昆虫病原真菌是自然界控制害虫群体的主要因素之一。与其它生物农药相比,真菌杀虫剂具有主动侵染寄主昆虫、可观的扩散效果、寄主不易产生抗性等优点,应用真菌制剂控制害虫危害一直受到人们的普遍关注。然而,目前昆虫病原真菌的基础研究相对薄弱,有关昆虫病原真菌发育、侵染及致病等方面的分子机理研究缺乏明晰的认识,在一定程度上限制了真菌杀虫剂的开发和利用。因此,加强对昆虫病原真菌的分子机理研究,对充分挖掘其在生物防治中的潜力具有重要意义。本论文以重要的昆虫病原真菌球孢白僵菌为材料,采用农杆菌介导转化球孢白僵菌获得大量T-DNA随机插入转化子,筛选低毒力或者无毒力突变体。对T-DNA转化子进行大规模的生物测定后筛选得到一株毒力下降明显的突变体Mu10。经生物学性状分析发现,突变体Mu10不仅毒力下降显著,且表型与野生型相比也有较明显变化。主要研究结果如下:1.突变体的筛选采用农杆菌介导法转化球孢白僵菌获得大量T-DNA随机插入转化子。经生物测定筛选得到一株毒力下降明显的突变体Mu10。在5×10~7个/mL的孢子浓度下,突变体Mu10对桃蚜的累积死亡率(168 h)比野生型降低了约80%左右。2.突变体的生物学性状分析①在营养丰富培养基(SDAY)上,突变体Mu10在正常培养及高渗条件(含1 mol/L NaCl)下的生长都比野生型缓慢,尤其是在高渗条件下,突变体的辐射状生长受到抑制较明显。然而,当在营养贫瘠的培养基(CZM)上,突变体Mu10在正常及高渗条件(含1 mol/L NaCl)下的生长状况与野生型相比没有明显差异。②提高培养温度至32℃,突变体Mu10在营养丰富的SDAY培养基上生长比野生型缓慢,菌落直径较小;在贫瘠的CZM培养基上,与野生型相比,突变体Mu10的菌落直径没有明显的差异,只是气生菌丝略发达。③在营养丰富的SDAY培养基上,突变体Mu10在正常与高渗(含1 mol/LNaCl)条件下的生物量比野生型分别降低了15.73%和32.85%;突变体Mu10的产孢量比野生型分别降低了58.70%和80.53%。在CZM培养基上,突变体Mu10在正常及高渗条件下的产孢量和生物量与野生型没有明显差异。,萌发率测定测定结果表明,接种16 h后野生菌株在SDAY和CZM平板上的萌发率达到100%,而突变体Mu10的萌发率只有64.67%和63.77%。④在正常及高渗条件下,突变体Mu10胞内甘油和阿拉伯糖含量均低于野生型,但两种培养条件下的降低量差异不显著;正常条件下,突变体胞内海藻糖的含量与野生型相比没有明显变化,但高渗环境下突变体胞内海藻糖的含量比野生型降低了40.13%;在正常及高渗条件下,突变体胞内赤藓糖含量与野生型相比均没有明显变化。3.T-DNA插入破坏序列的克隆利用YADE技术进行基因组染色体步移(Chromosome Walking),从突变体得到了插入突变相关序列(约1.9 kb)。在NCBI上经BLAST比对,未发现与T-DNAtagging序列具有同源性的基因序列,因此推测该序列为未知功能基因或者是相关基因的调控序列。4.同源重组载体的构建以及同源重组转化子的筛选为了进一步验证从Mu10得到的T-DNA侧翼序列的功能,根据克隆得到的T-DNA侧翼序列设计引物,扩增同源交换的左右臂,利用实验室已有的骨架载体pPZPtk8.10,构建了同源重组载体pPZPtk8.10-Mu10LB-bar-Mu10RB。利用农杆菌介导法转化球孢白僵菌,基于正负筛选的基因敲除策略,最后筛选得到两个同源重组转化子T5和T7,为研究球孢白僵菌的致病机理提供了研究材料。