反硝化作用是将硝酸盐和亚硝酸盐还原为气态氮化物和氮气的过程,对地球生态系统的物质循环和能量流动具有不可或缺的作用。该过程包含硝酸盐还原、亚硝酸盐还原、一氧化氮还原和氧化亚氮还原4个步骤,分别由硝酸盐还原酶、亚硝酸盐还原酶、一氧化氮还原酶和氧化亚氮还原酶4种金属酶催化完成,其中亚硝酸盐向一氧化氮的转化是速率控制步骤,因此检测亚硝酸盐还原酶编码基因nirS可以从分子生物学角度深入分析微生物种群特性和氮元素的转化规律,进而为评估生态环境健康状况等科研与生产活动提供支撑数据。用于nirS基因检测的常规方法,诸如聚合酶链式反应(PCR)、变性梯度凝胶电泳和基因芯片等,都有很高的灵敏度和准确度,但往往受限于专业实验室、专业技术人员和贵重仪器设备的需求,而且费用较高,因而很大程度上阻碍了它们在环境样品快速分析领域的应用。环介导等温基因扩增(Loop-mediated Isothermal Amplification,LAMP)是一种新型的核酸检测技术。体外扩增DNA时,LAMP过程无需升温、降温循环即可进行目标DNA片段的扩增,而且采用4条或者6条引物同时识别6个位点,较之于PCR,具有更高的效率和特异性。此外,更有意义的是,该反应对反应体系中干扰物质的耐受性较强,因而可以降低样品前处理要求,因而操作方便、应用成本低。本文主要包括两个部分的研究内容:一是模板DNA和铜绿假单胞菌(Pseudmonas aeruginosa PAO1)细胞中nirS基因的LAMP检测方法;二是活细菌、死细菌和胞外DNA中目标基因的LAMP检测机理。(1)以铜绿假单胞菌(P.aeruginosa PAO1)为模式细菌,提取基因组DNA,设计引物,优化LAMP反应条件,采用凝胶电泳表征反应产物,构建目标基因nirS的定量检测方法。结果表明,63℃和1 h反应条件下,最低检测限为1.87 pg/μL。以荧光染料Gene Finder表征反应产物,构建可视化LAMP模式,最低检测限同样可达1.87 pg/μL。较之于PCR方法,该灵敏度高出一个数量级。采用来自于大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等标准或环境分离菌株的基因组DNA为检测对象,结果表明实验所设计引物只能特异性地检测出P.aeruginosa PAO1中的nirS基因。此外,直接以P.aeruginosa PAO1细胞为模板的检测方法也得到了研究。结果表明,LAMP法在优化条件下对细胞的最低检测限为3.36×10~2 CFU/mL(反应时长1 h),PCR法则不能以细胞为模板进行检测。以模拟海水为研究对象,探讨所建nirS基因LAMP检测新方法的实用性。结果表明,对于基因组DNA模板,最低检测限为1.27×10~4 fg/μL;对于P.aeruginosa PAO1细胞模板,最低检测限为1.68×10~4 CFU/mL。总之,采用所构建的LAMP方法测定nirS基因,具有以下几个显著的特点:既可以以基因组DNA为模板,也可以直接以细胞为模板;较之于PCR,该反应对体系中复杂成分的耐受性更强;检测效率、灵敏度和特异性更高;过程无需大型昂贵仪器,为实现现场快检提供了可行性基础。(2)为了探讨活细胞可以直接作为模板进行目标基因检测的机理,实验以stx1基因作为研究对象,构建了LAMP检测方法,分别探讨以E.coli基因组DNA、死E.coli细胞和活E.coli细胞为模板的扩增过程特性。结果表明,63℃下,stx1基因都可以得到检测;前两种情况都是以游离的DNA为模板,而后者模板来自于活细胞的裂解(≤2 min)。此外,含有stx1基因的自来水和海水都可以直接作为模板进行LAMP检测,但是灵敏度显著低于采用纯化后的基因组DNA和活细胞,表明LAMP反应虽然对体系中复杂成分具有一定耐受性,但被抑制作用依然不可忽视。这个发现为考量现场快检目标基因的灵敏度提供直接数据支撑。