论文部分内容阅读
芸薹属作物是我国重要的蔬菜和油料作物,细胞质雄性不育(cytoplasmic male sterility, CMS)作为一种重要途径可运用于其杂种优势育种。高等植物的细胞质雄性不育与线粒体基因组重组密切相关,而线粒体基因组重组受核基因调控。因此研究影响线粒体基因组重组的核基因及线粒体基因组重组的机制,对于分析细胞质雄性不育的机理具有重要的意义。MSH1,RecA3以及OSB1是参与高等植物线粒体基因组重组的关键核基因。MSH1,即MUTSHOMOLOG1,编码MutS同源蛋白。高等植物中,MSH1蛋白的主要作用是抑制线粒体DNA的重组,维持线粒体基因组的稳定性。本研究对芸薹属(Brassica), Brassica rapa (AA), Brassica nigra (BB), Brassica oleracea (CC), Brassica napus (AACC), Brassica juncea (AABB), Brassica carinata (BBCC)的MSH1, RecA3和OSB1进行克隆,分析这三种基因在芸薹属作物中的功能与特性。并将MSH1-RNAi的载体转化至芸薹属芥菜种的榨菜(Brassica juncea Coss. var. tumida Tsen et Lee)中,构建了榨菜MSH1-RNAi系。观察MSH1基因被抑制后的表型变化和线粒体基因的重组情况,主要结果如下：1.芸薹属MSH1基因的克隆与特性：从全基因组数据库中获得B.rapa和B.napus的MSH1基因的编码序列,B.nigra和B.juncea的MSH1基因信息来自本实验室全基因组测序,B.oleracea和B.carinata的序列是本实验通过同源克隆测序获得,所有芸薹属作物的MSHl序列均通过PCR扩增验证。通过同源性比对分析,发现芸薹属几种作物中MSHl高度保守,编码区序列3.3kb左右,编码1120个左右的氨基酸,包含22个外显子和21个内含子,具有特殊的维持线粒体基因组稳定性的DNA错配修复结构。2.芸薹属OSB1和RecA3基因的克隆与特性：通过查找数据库和使用同源克隆的方法获得芸薹属B.rapa, B.napus, B.nigra, Bjuncea, B.oleracea和B. carinata的OSB1和RecA3基因的编码信息。同源性比对分析表明芸薹属几种作物中OSBl和RecA3高度保守。芸薹属中,OSB1和RecA3蛋白在线粒体DNA的重组、复制和修复中起到重要作用。3.榨菜MSH1-RNAi遗传转化株的获得：利用农杆菌介导法,将pGEG1008MSH1-RNAi载体转化进入榨菜植株,获得8株转化成功的To转基因株系。这8株转化株叶片的形状普遍发生改变,叶片出现黄化的症状,部分植株出现分支增多的表型。检测转化株中MSH1基因的表达情况,发现较野生型转录水平降低。将获得的8株To代转基因植株严格自交,获得T1代系。经过载体特异引物的PCR检测发现,后代发生分离,通过PCR检测获得T1代中含有MSH1-RNAi(T1+)和不含有MSH1-RNAi(Ti-)植株,其比例为3：1,表明To-2是单插入的杂合体。4.T1代MSH1基因表达量的分析：检测T1代MSH1基因的表达水平,发现T1+转化株MSH1的表达水平较野生型显著降低,T1-植株MSH1的表达水平基本恢复到正常水平。在表型上,T1代幼苗期的生长速率较野生型明显减慢,T1代苗期普遍矮小。T1代转基因植株的线粒体基因组发生重组,nad2基因的亚化学计量发生改变。