中药复方是指在中医药基础理论指导下,中药经配伍理论形成的中药混杂体,临床运用十分广泛。而中药经典名方又是几千年来我国劳动人民与疾病斗争的过程中通过实践,不断认识,经临床筛选而来,是中华民族智慧的结晶,许多经典名方经过现代工艺改造,已经被《中国药典》收录。但复方的疗效、质量控制与用药安全,始终是国内及国际上广泛关注的热点,究其原因是代表复方质量控制的成分未必是药效成分,西药模式的单一或多指标的化学指标性成分不足以说明中药复方质量的好坏,对质量控制意义不大,难以反映复方的真实疗效。复方疗效的药效物质及其作用机制研究不明确,是质量控制的困难所在。且寻找适于中药复杂体系评价的研究方法,阐明中药效应物质基础及作用的本质,一直是中药研究的首要科学问题。而课题组前期研究工作基础是进行拆方研究,分别在黄芪中遴选出5个能够以原型吸收入血的质量控制成分,在当归中筛选出了4个有效成分,其中一个已知成分洋川芎内酯I可以以原型吸收入血,尚没有将当归和黄芪组合进行研究,且并不清楚配伍后复方对药效质控成分的影响,是两单味药选出的质控成分相叠加,还是配伍后有其他成分的增减,值得进行深入研究。前期研究技术和成果为组方的后续研究提供技术和数据支撑,在此背景下展开对当归补血汤的质控成分遴选研究。研究目的与方法本实验以当归补血汤为研究对象,在前期研究的基础上,对当归和黄芪进行还原配伍,整体系统地研究复方药效物质成分及其变化情况,遴选配伍后的复方的质控成分,阐述其成分变化机制。进而为当归补血汤遴选质控成分,为中药及其复方质控成分的筛选提供可供参考的方法。以中药传统剂型汤剂为载体,对当归补血汤进行水煎煮,以序贯代谢思路为指导,首先对当归补血汤进行胃肠道物理环境稳定性考察,其次采用在体封闭肠环法-腹主动脉采血对当归补血汤进行代谢研究,运用高效液相色谱法、液质联用色谱法等现代色谱技术对血液样品进行成分对比分析,研究当归补血汤药效成分的变化过程,遴选当归补血汤的质量控制成分。研究结果1当归补血汤化学成分研究① 高效液相色谱法当归补血汤多成分研究高效液相色谱法建立当归补血汤特征图谱,确定14个化合物的色谱峰,经对照品比对出5个已知化合物,分别为毛蕊异黄酮,芒柄花素,芒柄花苷,毛蕊异黄酮葡萄糖苷,洋川芎内酯I。②基于LC-MS/MS技术当归补血汤多成分研究根据已知色谱条件对补血汤中5种对照品混合溶液和当归补血汤进行分析,建立当归补血汤液质联用特征图谱,共得到31个化合物成分信息,主要有黄酮类,苯酞类,皂苷类成分。经对照品鉴别的当归补血汤中的成分分别有毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、黄芪甲苷、芒柄花素。余下的26个峰为结合文献,通过化合物精确分子量和裂解规律进行判断得到。2基于高效液相色谱法的胃肠道稳定性研究当归补血汤在经人工含酶胃液和人工含酶肠液温孵后,经过对相对峰面积比与成分随时间的变化规律分析,以及药物成分在一般情况下在胃液2h和在肠液4h内基本不发生变化,指定的当归补血汤中的14个成分在人工胃肠道中基本不发生变化,保证了当归补血汤在消化道环境下的稳定性,有利于开展下一步多成分序贯代谢研究。3当归补血汤多成分吸收代谢研究①基于高效液相色谱法研究当归补血汤肠道菌、肠壁酶、肠无菌、肝代谢成分变化利用高效液相色谱法对肠道菌、肠壁酶、肠有菌、肝代谢进行对比分析,发现有7个成分能够以原型吸收进入血液循环,其中5个为已知成分;其中2个新成分是肠代谢产物,2个新成分是肝代谢产物。基于序贯代谢理论,结合高效液相色谱法初步考察当归补血汤多成分代谢连续性,初步遴选出7个原型成分作为当归补血汤质控成分。②基于LC-MS/MS技术当归补血汤多成分序贯代谢变化研究LC-MS/MS成分分析,遴选出 Calycosin-7-O-β-D-glucoside、Ferulic acid、Ononin、Calycosin、6"-O-malonate-glycetein-7-O-β-D-glucoside、Senkyunolide Ⅰ Formononetin、AstragalosideⅣ、isomer of(6aR,11 aR)-3-hydroxy-9,10-dimethoxy-pterocarpan、Astraisoflavan-7-O-β-D-glucopyranoside、Z-ligustilide、E-ligustilide、Senkyunolide A、(6aR,11aR)-3-hydroxy-9,10-dimethoxy-pterocarpan 在内的 14 个可以以原型吸收入血的成分。其余成分分别在肠道菌、肝代谢和肠壁酶的作用下发生了不同程度的代谢转化,当归补血汤发生转化的类型主要包括还原,葡萄糖醛酸化,去甲基化,脱糖,羟基化等。结论以序贯代谢为理论指导,通过在体封闭肠环法并结合现代色谱技术,从当归补血汤中遴选出洋川芎内酯Ⅰ,黄芪甲苷,芒柄花素,芒柄花苷,毛蕊异黄酮,毛蕊异黄酮葡萄糖苷、洋川芎内酯Ⅰ等能够以原型吸收入血的成分作为当归补血汤的质控成分;研究还发现有些原型成分的代谢产物均可在肝肠中被找到,以代谢产物的形式吸收入血进入体循环,由此可用其他技术手段对其代谢产物进行追踪找到原型成分。在此基础上,筛选出的药效成分为当归补血汤的进一步定量分析提供数据支撑。创新点(1)首次采用序贯代谢理论研究当归补血汤的药效成分,遴选质控成分。(2)采用在体封闭肠环-腹主动脉取血法研究当归补血汤成分动态变化过程,阐述其在肝肠的变化机制,可为中药复方质量控制成分的研究提供新方法。