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研究背景:急性淋巴细胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia,ALL)是一组遗传学高度异质性疾病,虽然目前多药联合的诱导治疗方案明显提高了完全缓解(complete remission,CR)率,但是CR后即使大剂量的巩固化疗及造血干细胞移植,仍有相当一部分患者出现耐药及复发,一旦复发预后很差。有研究发现抗凋亡蛋白Bcl-2(B-cell lymphoma 2)亚家族过表达参与了肿瘤耐药。ABT-199(venetoclax)是模拟BH3-only的小分子物质,口服生物利用率高,能够选择性抑制抗凋亡蛋白Bcl-2,激活线粒体通路,从而诱导细胞凋亡。目前ABT-199在治疗急慢性白血病领域的研究还处在基础阶段或者临床试验阶段,该分子靶向药物对ALL细胞的作用目前报道不多。研究目的:本研究旨在探讨ABT-199体外对急性淋巴细胞白血病细胞增殖凋亡的影响及其分子机制。研究方法:1、检测细胞增殖:通过CCK-8法检测不同浓度的ABT-199处理Molt4及Nalm6细胞48h后,检测对细胞的增殖抑制作用。2、DAPI细胞核荧光染色:ABT-199处理Molt4细胞48h,DAPI细胞核染色后利用荧光显微镜观察细胞凋亡特征。3、流式细胞仪检测细胞凋亡:ABT-199处理Molt4及Nalm6细胞后收集细胞,经Annexin-V/PI双染法染色,流式细胞仪上机检测细胞凋亡率。4、Caspase抑制实验:泛Caspase抑制剂(Z-VAD-fmk)预处理Molt4细胞2h后,再用ABT-199作用Molt4细胞24h,然后流式上机检测细胞凋亡率。5、JC-1染色测定线粒体膜电位的变化:应用JC-1探针检测ABT-199对Molt4细胞线粒体膜电位的影响。6、相关通路中蛋白水平的变化:采用Western blotting技术(蛋白免疫印迹法,WB)检测 ABT-199 处理 Molt4 细胞 24h 后 Bcl-2、cleaved-Caspase-3、PARP 及Bax蛋白表达水平的变化。7、统计分析:运用专业统计学软件SPSS 20.0进行统计分析。本实验数据均为计量资料,采用均数±标准差(即Mean±S.D)表示;由于样本量较少,多个独立样本间的比较采用多个独立样本非参数(Kruskal-WallisH)检验进行统计学分析,以α=0.05为检验水准,所有检验均为双侧检验。研究结果:1、ABT-199对Molt4及Nalm6细胞具有增殖抑制作用,其IC50浓度分别为(4.63±0.15)μmol/L、(9.79±0.06)μmol/L。2、ABT-199作用Molt4细胞48h经荧光显微镜观察,可以观察到细胞核染色质染色浓聚,细胞核碎裂,出现凋亡小体,且随着药物浓度的增加上述形态变化更加明显。3、Annexin-V-APC/PI染色后流式上机检测细胞凋亡率,结果显示ABT-199能诱导Molt4及Nalm6细胞凋亡,呈浓度依赖性。多个独立样本非参数检验表明ABT-199处理组与对照组的凋亡比例差异均有统计学意义(χ2=18.286,v=4,P=0.001;χ2=9.900,v=4,P=0.042)。4、我们发现在Molt4细胞中,广谱Caspase抑制剂Z-VAD-fmk能抑制ABT-199的凋亡诱导作用。单用ABT-199与Z-VAD-fmk(20μmol/L)预处理后再ABT-199处理后诱导的凋亡率具有统计学意义(P<0.05)。该结果提示ABT-199诱导急性淋巴细胞白血病细胞凋亡作用具有Caspase依赖性。5、用线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)检测ABT-199对Molt4细胞线粒体膜电位的影响,结果显示ABT-199能促使Molt4细胞的线粒体膜电位下降,随着浓度升高,膜电位下降越明显。多个独立样本非参数检验表明给药组与对照组的线粒体膜电位下降比例差异有统计学意义(χ2=17.386,v=4,P=0.002)。上述结果表明,ABT-199作用于Molt4细胞后可显著下调线粒体膜电位,并呈现浓度依赖关系。6、Western blotting结果提示ABT-199诱导白血病细胞凋亡的分子机制与激活细胞线粒体凋亡通路有关:ABT-199作用Molt4细胞24h后,线粒体通路中Bcl-2表达水平下降,并出现Caspase-3下游底物PARP(即多聚核糖聚合酶)的活化及cleaved-Caspase-3浓度依赖性升高。多个独立样本非参数检验显示,ABT-199处理组与对照组中Bcl-2的表达水平比较,差异有统计学意义(χ2=9.024,v=3,P=0.029);ABT-199处理组与对照组 Cleaved-PARP 比较,差异同样有统计学意义(χ2=7.619,v=3,P=0.045)。结论:1、ABT-199对急性淋巴细胞白血病细胞具有增殖抑制作用,并呈剂量依赖性。2、ABT-199能诱导急性淋巴细胞白血病细胞凋亡。3、ABT-199诱导急性淋巴细胞白血病细胞凋亡是通过Caspase介导的。4、ABT-199可能是通过下调线粒体信号通路中的Bcl-2蛋白表达水平,促使Bax转位,导致细胞线粒体膜电位(MMP)水平下降,进而活化Caspase-3及PARP等蛋白,最终促使急性淋巴细胞白血病细胞株Molt4细胞和Nalm6细胞凋亡。