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目的:研究表明,高钙导致晶状体上皮细胞(lens epithelial cells,LECs)钙稳态丧失与白内障的发生密切相关。故本课题拟在高钙培养状态下,研究衰老标记蛋白30(senescence marker protein 30,SMP30)表达量的改变对人LECs系SRA01/04细胞增殖、凋亡及氧化应激的影响,拟进一步完善SMP30在白内障领域的基础研究。方法:本实验分为5组:SMP30高表达组(SMP30 over-expression group,OE)、SMP30 高表达阴性对照组(negative control OE group,NCOE)、SMP30沉默组(SMP30 knock down group,KD)、SMP30 沉默阴性对照组(negative control KD group,NCKD)及空白对照组(blank control group,CON)。根据本课题组前期实验基础,选择已构建成功的分别携带OE、NCOE、KD及NCKD基因的慢病毒载体,在预实验已确定的优化条件下,以感染复数(multiplicity of infection,MOI)等于5为基础,配制含适量的慢病毒及终浓度为5μg/mL Polybrene(助感染试剂)的完全培养基,培养及转染SRA01/04细胞,构建SMP30高表达及沉默SRA01/04细胞模型。根据预实验结果,用含15 mmol/L CaC12的完全培养基培养SRA01/04细胞24小时,用于模拟白内障形成时LECs处于高钙/钙紊乱的病理状态。后续用BrdU-Elisa法检测细胞增殖能力、CCK8法检测细胞活力、PI-FACS法检测细胞周期情况;Annexin V-APC单染法检测细胞凋亡率;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)试剂盒(WST-1 法)检测细胞总 SOD 活力,评估细胞抗氧化能力;谷胱甘肽试剂盒检测细胞内氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione,GSSG)/总谷胱甘肽(total glutathione,T-GSH)水平,评估细胞内氧化应激水平。结果:(1)在最佳转染实验条件下,经过携带目的基因的慢病毒载体转染细胞后,用显微镜观察各组转染细胞,可见有大量绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)表达,转染效率接近80%,且细胞形态与未转染的SRA01/04细胞(CON组)相似,其生长状态良好,转染细胞多次传代后形态均一且性状尚稳定,提示SMP30高表达或沉默SRA01/04细胞模型构建成功。(2)在高钙培养状态下(15 mmol/LCaCl2作用24小时),显微镜下可见大部分SRA01/04及转染细胞出现变形皱缩,边界不清,部分细胞呈长条形并长触角,有细胞出现碎裂、溶解。(3)每组细胞增殖情况:①BrdU-Elisa法检测结果显示:在高钙培养状态下,OE组(3.89±0.20)细胞相对增殖能力均高于 NCOE 组(2.82±0.34,P=0.003)及 CON 组(2.96±0.25,P=0.006),NCOE组与CON组相比差异无统计学意义(P=0.551)(n=3,F=13.627,P=0.006);KD组(2.42±0.08)相对细胞增殖能力均低于NCKD组(2.95±0.08,P=0.006)及 CON 组(P=0.006),NCKD 组与 CON 组相比差异无统计学意义(P=0.971)(n=3,F=11.510,P=0.009)。②CCK8检测结果提示,在高钙培养的第1-5天内,每组细胞活力均可成指数性增长(n=5,P=0.000),除CON组与NCKD组比较差异无统计学意义外(P=0.788),其余组间任意两两比较差异均有统计学意义,其中OE组最高,KD组最低(n=5,P=0.000)。③PI-FACS法检测结果提示:在高钙培养状态下,OE组处于G1期(46.90±2.17%)的细胞构成比低于CON组的G1期(66.37±1.11%,P<0.05),OE组处于S期(40.40±2.46%)的细胞构成比高于CON组的S期(20.81±1.25%,P<0.05)(n=3,x2=30.594,P=0.000);KD 组处于 S 期(15.25±0.88%)的细胞构成比低于 NCKD 组的 S 期(25.97±0.77%,P<0.05)(n=3,x2=12.261,P=0.016)。(4)每组细胞凋亡情况:Annexin V-APC 单染法检测结果提示:在高钙培养状态下,OE组(1.66±0.20%)细胞凋亡率低于NCOE 组(2.36±0.22%,P=0.004)(n=3,F=29.136,P=0.001);KD 组(6.11 ±0.03%)细胞凋亡率显著高于 NCKD 组(1.83±0.05%,P=0.000)及CON 组(1.22±0.12%,P=0.000)(n=3,F=3810.28,P=0.000)。(5)每组细胞氧化应激情况:①SOD活性检测结果提示:在高钙培养状态下,OE组(47.49±4.34 U/mg)SOD 活力显著高于 NCOE 组(30.55±4.15 U/mg,P=0.001)及 CON 组(26.76±1.49 U/mg,P=0.000),NCOE 组与 CON 组相比差异无统计学意义(P=0.241)(n=3,F=28.635,P=0.001);KD 组(11.69±0.53 U/mg)SOD 活力显著低于 NCKD 组(31.10±2.24 U/mg,P=0.000)及 CON 组(P=0.000),NCKD 组 SOD 活力高于 CON 组(P=0.015)(n=3,F=124.249,P=0.000)。②谷胱甘肽含量检测结果提示:在高钙状态下,OE组GSSG/T-GSH 比值(2.36±0.51)低于 NCOE 组(16.36±2.48,P=0.000)及CON组(20.12±2.54,P=0.000),NCOE组和CON组相比差异无统计学意义(P=0.068)(n=3,F=61.306,P=0.000);KD 组 GSSG/T-GSH 比值(70.80±2.34)明显高于 NCKD 组(15.93±3.47,P=0.000)及 CON 组(P=0.000),NCKD组和CON组相比差异无统计学意义(P=0.119)(n=3,F=349.813,P=0.000)。结论:在高钙培养状态下,SMP30表达量的增加可提高人LECs系SRA01/04细胞增殖活力,降低细胞凋亡率,提高细胞抗氧化能力,从而降低细胞氧化应激水平,提示增加SMP30的表达量可能对人LECs具有调控细胞增殖、抑制细胞凋亡及抗氧化应激的保护作用,在一定程度上可缓解高钙诱导细胞损伤的进程。