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目的:探讨多重连接依赖探针扩增( Multiple ligation-dependent probe amplification,MLPA)技术结合DNA和cDNA测序对杜氏肌营养不良症(duchenne muscular dystrophy,DMD)和脊髓性肌萎缩(Spinal muscular atrophy, SMA)患者及携带者基因检测的临床应用价值,并在此基础上研究MLPA技术对家系中高致病风险胎儿进行产前基因诊断的临床应用,为进一步创建稳定可靠的DMD和SMA产前诊断技术平台奠定基础。方法:运用MLPA技术对2008年2月至2010年4月来深圳市儿童医院儿科研究所及我院就诊的32个DMD家系中现存41例DMD患者、29例女性可能携带者、6例家系中健康男性成员、10例女性健康对照和10例男性健康对照共96人采集外周血提取基因组DNA,运用MLPA技术对以上96人的DMD基因79个外显子进行分析;并于患者行病理活检术时取右侧腓肠肌10-30mg肌肉组织提取RNA,逆转录成cDNA;根据研究需要选择性进行DNA及cDNA序列测定,验证MLPA检测结果的可靠性;同期,对22例SMA患者及双亲39人,并选择与患者无血缘关系、否认遗传病家族史的正常男性和女性对照各15人共91人进行运动神经元生存基因(survival motor neuron gene,SMN)检测,用聚合酶链反应结合限制性内切酶片段长度多态性技术(Polymerase Chain Reaction restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)和DNA测序技术对MLPA检测结果进行验证。在此基础上,对2个DMD和1个SMA产前诊断家系中具有高患病风险的3个胎儿于16-22孕周经羊膜腔穿刺术抽取羊水,提取胎儿羊水DNA,采用MLPA技术并结合DNA测序技术对胎儿进行产前基因诊断。结果:MLPA检测32个DMD家系中现存41例患者,其中男性患者39例,女性患者2例。39例男性患者中外显子缺失27例(69.23%),外显子重复3例(7.69%),余9例未检测到外显子缺失和重复(23.08%)。27例外显子缺失的患者中有24例缺失范围在外显子42～55热点区域,7例缺失范围在外显子9～22热点区域,其中患者10和患者19～21其缺失外显子范围较大包含了以上的两个突变热点区域。2例女性患者MLPA图谱分别为外显子47～50和外显子35信号比正常女性明显降低,似女性携带者,其突变外显子信号峰值比正常对照显著降低。结合其临床表现推测可能在另一条X染色体的DMD基因同时存在点突变。在外显子缺失及重复家系中接受检测的29例女性可能携带者中检测出18例为外显子缺失携带者,2例为外显子重复携带者,其MLPA图谱中外显子峰信号降低及增高的位置与先证者外显子缺失或重复位置一致;余9例未检测到信号异常。对于4例外显子缺失的患儿母亲,未检测到相应外显子信号异常,推测其患儿可能为新发突变。DMD产前诊断家系1中IV2女性胎儿,MLPA结果为DMD致病基因携带者。家系2中V3男性胎儿MLPA结果显示无DMD基因Exon43缺失,并经羊水DNA测序结果证实了DMD基因Exon43存在,胎儿已出生,肌酶检测及基因检测均无异常。MLPA检测22例SMA患者中16例为SMN1的外显子7和外显子8缺失纯合子,6例为SMN1外显子7缺失纯合子;39名双亲的SMN1外显子7的信号值均明显比正常对照组平均信号值低30%～50%。PCR-RFLP和DNA测序技术支持MLPA有关SMN基因检测结果。SMA产前诊断家系先证者为SMN1外显子7合并外显子8缺失纯合子,胎儿和先证者基因突变类型相同,患儿已引产,其脐带血DNA检测结果与羊水诊断结果一致。结论: MLPA技术能简便、快速、有效地检测DMD和SMA所有外显子的缺失与重复,结合DNA和cDNA测序技术能对患者及携带者进行可靠的基因诊断,并在此基础上对家系中具有高致病风险的胎儿进行有效的产前基因诊断。MLPA技术结合DNA和cDNA测序在对DMD和SMA的基因诊断和产前基因诊断中具有较高的临床实际应用价值。