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猪瘟(classical swine fever;CSF)是由猪瘟病毒(classical swine fever virus;CSFV)引起的猪的一种高度接触性和致死性传染病,以发热和出血为主要特征。猪瘟呈世界性分布,国际兽医局将其列为A类16种法定传染病之一。 参照中国猪瘟病毒兔化弱毒株的基因组序列,设计7对覆盖全长基因组的引物,采用RT-PCR的方法扩增猪瘟病毒全基因组cDNA,克隆、测序,利用序列拼接软件获得猪瘟病毒C81/WHHV株基因组全长cDNA序列(GenBank:AY663656)。C81/WHHV株基因组全长12310bp,包含一个开放阅读框,编码3898个氨基酸的聚蛋白前体。序列分析表明,C81/WHHV株ORF与猪瘟病毒弱毒株核苷酸序列同源性为84.4%-99.6%,氨基酸序列同源性为91.6%-99.4%。同时,比较了CSFV5’-NTR特征序列并预测了C81/WHHV株聚蛋白前体的功能域。 设计一组引物将扩增到的不同长度的NS2基因克隆至表达载体pGEX-KG中,分别构建不同重组表达质粒pKG-NS2、pKG-NS876、pKG-NS400,鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导,经SDS-PAGE分析发现:只有pKG-NS400的菌体裂解产物在分子量约为40kDa处出现和预期的目的蛋白分子量相符的条带;Western-blot检测表明,表达产物能与猪瘟病毒阳性血清发生特异性反应,出现单一反应带,该表达产物主要存在于包涵体中。而其它的菌体裂解产物没有目的蛋白表达。 将扩增到的全长NS2基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组质粒pCD-NS2,经脂质体介导转染哺乳动物细胞PK-15后,间接免疫荧光检测表明:NS2蛋白初步实现了在哺乳动物细胞中的表达,表达的NS2蛋白主要在细胞膜上。这将为下一步建立稳定表达NS2蛋白的细胞系及为NS2蛋白互补试验的研究打下基础。 利用酵母密码子偏爱性,设计一对引物扩增了NS2基因,将其克隆到酵母表达载体pPIC9K,构建重组表达质粒p9K-NS2,转入巴斯特毕赤酵母GS115中,甲醇诱导表达后,经SDS-PAGE银染、Western-blot检测证实NS2未能在酵母中实现表达,这可能与酵母菌对密码子使用的偏爱性有关,虽突变了NS2基因两端的部分碱基,但基因内部的密码子对基因还是有很大的影响。