香蕉是热带亚热带重要的经济作物,在香蕉的生长过程中,许多因素限制了其生长,甚至导致大量减产,例如香蕉叶斑病和香蕉枯萎病。因此,研究生物胁迫对香蕉影响的分子机理对香蕉抵抗生物胁迫有非常重要的理论意义,为今后抗病育种提供了良好的基础。钙依赖蛋白激酶基因(CDPK)在抵抗病原菌侵染的过程中起到了重要的作用。本研究根据本实验室积累的工作,在已获得的MaCDPK4基因全长的基础之上,通过构建植物过表达载体转入烟草探究其功能;构建酵母双杂交诱饵载体,筛选与其互作的蛋白,取得结果如下:(1)构建了酵母双杂交诱饵载体pGBKT-7-MaCDPK4,转入酵母菌AH109进行自激活与毒性检测,在SD/-Trp/X-α-Gal,SD/-Ade/-His/-Trp/X-α-Gal固体培养基中并未发现蓝色菌斑,表明其无法自激活,在SD/-Trp固体培养基中,带空载体与带重组质粒的菌落生长情况一致,表明无毒性,适合进行酵母双杂交下一步实验。(2)构建了香蕉受香蕉枯萎病菌生理小种4号(FOC4)侵染后根的cDNA文库,将其与诱饵载体,文库载体共转入酵母菌AH109中进行酵母双杂交,将可能的阳性克隆测序,得到的片段进行BLAST获得腺苷甲硫氨酸合成酶SAMS,衣被蛋白还有一些未知蛋白等一系列候选蛋白。构建pGADT7-SAMS载体进行酵母双杂交验证,在SD/-Leu/-His/-Ade/-Trp/X-α-Gal固体培养基中菌落生长并带蓝色,初步说明MaCDPK4与SAMS存在互作关系。(3)为了深入研究MaCDPK4基因在香蕉对病原菌的应答中起到的作用,本实验构建了MaCDPK4基因的植物过表达载体pVKH-MaCDPK4,通过根瘤农杆菌EHA105介导的遗传转化侵染烟草愈伤组织将植物过表达载体pVKH-MaCDPK4转化本氏烟草,使用30ug/ml潮霉素筛选各代种子(T1-T3)获得了 5个MaCDPK4转基因烟草纯合株系,选用其中3个株系进行病原菌处理。(4)选用菌液孢子浓度108作为侵染浓度,侵染从培养基移栽出来10d的烟草,7d时MaCDPK4转基因烟草与野生型烟草与未受菌液侵染的对照相比生长皆受到抑制,侵染7d后,受菌液侵染的野生型烟草的叶片逐渐发黄,而转基因烟草发黄程度弱于野生型烟草。通过对受侵染的转基因烟草与野生型烟草的荧光定量PCR分析发现抗病相关基因LOX1,PR2,PR4在野生型中表达不高,但在转基因烟草中表达明显增强;在转基因烟草中,水杨酸,茉莉酸合成及信号途径相关基因表达明显增强。而NTSAMS基因表达在野生型中下调,在转基因烟草中先上调后下调。根据以上结果表明,MaCDPK4与SAMS存在互作关系,SAMS可能参与抗FOC4;并且可能通过水杨酸与茉莉酸途径参与了烟草抵抗香蕉枯萎病菌的反应。