肌萎缩侧索硬化(ALS)与额颞叶痴呆(FTD)是严重危害人类健康的神经性退行疾病,但它们的发病机制并不十分清楚。已有研究发现,C9orf72基因第一个内含子区的GGGGCC六核苷酸重复扩增是导致C9orf72相关的ALS与FTD的主要遗传因素。该类ALS与FTD(C9orf72相关的ALS与FTD)患者的C9orf72基因中通常携带一个GGGGCC重复次数为3～30次的正常的等位基因及一个GGGGCC重复次数为几百甚至上千次的致病等位基因。目前,关于C9orf72基因GGGGCC六核苷酸重复扩增导致疾病发生的可能分子机制主要有三种:第一,GGGGCC重复扩增导致C9orf72蛋白单倍剂量不足,使其正常功能丧失而致病;第二,GGGGCC重复扩增序列转录后会聚集在一起形成RNA灶,其招募RNA结合蛋白,通过影响RNA结合蛋白的正常功能而致病;第三,GGGGCC的重复扩增序列通过重复相关无起始密码子翻译(repeat-associated non ATG-dependent translation)机制形成具有毒性的重复二肽而致病。然而,究竟上述哪一种机制是导致C9orf72相关的ALS与FTD的主要原因,还未有定论。为了便于本实验室研究C9orf72相关的ALS与FTD发生的分子机制以及开发C9orf72相关的ALS与FTD的治疗药物,本课题主要从以下四个方面进行了初步探索。1.制备针对人源C9orf72蛋白的单克隆抗体:利用纯化的C9orf72原核蛋白及表达C9orf72蛋白的DNA疫苗,对BALB/c小鼠进行交叉免疫,制备了针对人源C9orf72蛋白的单克隆抗体。最终通过Western blot实验证实,所获得的46A8株抗体可特异性识别外源表达的原核及真核C9orf72蛋白。为后续C9orf72蛋白功能的研究提供了重要的实验工具。2.建立 C9orf72-T2A-Luciferase KI 的 HEK293 细胞模型:首先,构建在 C9orf72基因最后一个编码外显子之后可产生双链断裂的sgRNA与Cas9共表达的打靶载体。然后,构建由上下游同源臂介导的可将T2A-Luciferase外源基因定点整合至C9orf72基因编码框之后的供体载体。将打靶载体与供体载体共同转染至HEK293细胞,经过抗性药物筛选与细胞克隆化之后,通过PCR及测序实验证实成功获得了C9orf72单等位基因插入外源Luciferase报告基因的单克隆C9orf72-T2A-Luciferase KI HEK293 细胞模型;最后,利用 Real-Time PCR 实验证实该细胞系中Luciferase的表达量与C9orf72基因mRNA的表达量呈正相关,因此通过检测Luciferase活性的变化,便可以初步确定C9orf72基因表达的变化。该细胞系的建立为高通量筛选针对C9orf72单倍剂量不足的小分子药物奠定了实验基础,在该领域具有重要的应用价值。3.利用C9orf72基因敲除的细胞模型研究C9orf72基因在调节细胞炎症方面的作用:设计靶向C9orf72基因第一个编码外显子的sgRNA,构建可共表达sgRNA与Cas9的慢病毒载体,成功包装慢病毒后感染U937细胞,经过抗性药物筛选与细胞克隆后,通过PCR及测序实验证实成功获得了 C9orf72基因中单等位基因敲除的U937细胞模型(C9orf72+/-U937)。用终浓度为1μg/mL的脂多糖体外刺激 C0orf72+/-U937 细胞,然后通过 Real-Time PCR 检测了 IL-1β,IL-6,IL-8,IL-10,TNF-α细胞因子mRNA水平的变化,结果显示,与正常U937细胞相比,C9orf72基因敲除的U937细胞模型中IL-6,IL-8,TNF-α及IL-10细胞因子mRNA的表达量显著升高,表明C9orf72基因在调节U937细胞炎症方面具有重要的作用。该细胞模型的建立为研究C9orf72基因功能及探索C9orf72单倍剂量不足的致病机制奠定了重要基础。4.建立C9orf72 GGGGCC六核苷酸重复KI的HEK293细胞模型:首先通过合成两端带有限制性酶切位点的(GGGGCC)6 DNA引物,利用同尾酶连接的方式,获得了 GGGGCC重复次数约为200次的间隔重复序列。然后构建在C9orf72基因第一个内含子区可产生双链断裂的sgRNA与Cas9共表达的打靶载体。同时构建由上下游同源臂介导的可将(GGGGCC)150的重复序列定点整合至C9orf72基因第一个内含子区的供体载体。将打靶载体与供体载体共同转染至HEK293细胞,经抗性药物筛选后,初步通过PCR及测序实验证实获得了在C9orf72基因第一内含子区插入含有(GGGGCC)10～70间隔重复序列的细胞模型。该细胞模型的建立为后续研究GGGGCC重复序列参与疾病的发病机制以及通过CRISPR/Cas9技术建立C9orf72 GGGGCC六核苷酸重复扩增的动物模型奠定了基础。综上所述,本课题成功构建了可用于C9orf72功能研究的三种不同的细胞模型,为本实验室后续阐明GGGGCC六核苷酸重复扩增导致C9orf72相关的ALS与FTD的分子机制奠定了重要基础,具有重要的研究意义及应用价值。