论文部分内容阅读
蚊媒传播的疟疾是一种严重危害人类健康和生命的热带传染病,在全世界人群中具有很高的发病率和致死率,已成为全球最重要的公共卫生问题之一,世界卫生组织已将疟疾和艾滋病、结核病一起列为全球三大公共卫生问题。准确诊断一直是疟疾防治工作的一个重要环节,显微镜检查作为金标准目前仍是诊断疟疾的主要手段。但是镜检需要专业的实验操作技术和丰富的经验,如今有经验的镜检人员越来越缺乏；PCR检测是另一种广泛使用的方法,尽管其敏感性高,但耗费时间长且需要特殊仪器、检测成本较高。因此迫切需要一种敏感、特异和简便的疟原虫检测方法。目的运用环介导等温扩增技术(Loop-mediated Isothermal Amplification,LAMP)建立一种快速、简便、敏感度高的疟原虫检测方法。方法本研究确定疟原虫环子孢子蛋白(CSP)基因为靶基因,设计合成特异性LAMP引物。构建间日疟原虫18S核糖体小亚基ssRNA特异性基因片段的重组质粒DNA (Pv-rDNA)作为阳性对照。优化Mg2+浓度、dNTPs浓度、Bst DNA聚合酶添加量、反应温度、时间以及设计引物缺省试验。评估优化后的LAMP反应的特异性和灵敏性。检测133份患者血样,以显微镜检方法为金标准,比较LAMP和多重PCR法检测间日疟原虫的敏感性和特异性。初步应用LAMP法检测斯氏按蚊体内鼠约氏疟原虫,对其特异性和灵敏性进行评估。结果建立了采用LAMP技术快速检测人体内间日疟原虫的方法,LAMP法检测重组质粒DNA (Pv-rDNA)的灵敏度达到10-10,为传统PCR方法的100倍。镜检确诊的68例间日疟患者,43例恶性疟患者和22例非疟疾患者中,LAMP法和多重PCR检测间日疟原虫的敏感性为98.53%和97.06%,两法检测灵敏度一致；特异性为86.15%和100%,LAMP法低于多重PCR法。LAMP法的阳性预测值和阴性预测值分别为88.16%和98.25%,多重PCR的阳性预测值和阴性预测值分别为100%和97.01%。选择斯氏疟原虫唾液腺子孢子微线体SPECT2作为靶基因合成LAMP反应引物,用该法初步应用于斯氏按蚊体内鼠约氏疟原虫的检测,特异性好,敏感性为能检测出在80只阴性斯氏按蚊中有1只约氏疟原虫阳性的斯氏按蚊的混合样本。结论本研究建立的人体内间日疟原虫LAMP检测方法具有快速简便、敏感性高、设备要求低、成本低廉的特点,具有较好的现场应用前景；LAMP法初步应用于斯氏按蚊体内鼠约氏疟原虫的检测,特异性和敏感性均较好,为进一步研究蚊体内疟原虫子孢子LAMP法检测奠定基础。