论文部分内容阅读
T细胞淋巴瘤是一种来源于T细胞的恶性增殖性疾病。2008年WHO淋巴瘤新分类标准中T细胞部分包括T-淋巴母细胞白血病/淋巴瘤和成熟T/NK细胞淋巴瘤两大类,后者又包括结外NK/T细胞淋巴瘤,外周T细胞淋巴瘤,成人T细胞白血病/淋巴瘤等多个类型。T细胞淋巴瘤在全球都有发病,且发病率呈现明显的地区差异,中国、日本、韩国等亚洲国家和北美地区发病率明显高于其他地区。T细胞淋巴瘤发病机制目前尚不清楚,异质性强,不同亚型临床表现各异,分型和诊断一直存在争议。相比B细胞淋巴瘤,T细胞淋巴瘤恶性程度更高,进展迅速,预后差,目前尚无针对本病统一的最佳治疗方案,亟待新药的开发。葫芦素(cucurbitacin)是从葫芦科和十字花科中提取的四环三萜类化合物,具有退热、阵痛、抗炎、抗菌、抗肿瘤等作用。根据化学结构不同,葫芦素家族被分为葫芦素A到T共17个亚型。葫芦素B、D、E、I因抗瘤作用显著被广泛研究。其中葫芦素D与葫芦素I化学结构相似,仅有两处不同:一处不同是葫芦素D结构中C1与C2之间为单键,葫芦素I相应位置为双键;另一处不同为空间构型差异。具有抗癌活性的葫芦素可以引起细胞周期阻滞,生长抑制和凋亡,分子机制涉及多种信号通路。葫芦素抗肿瘤作用机制与其化学结构密切相关。所在课题组一直致力于葫芦素D抗肿瘤机制的研究,发现葫芦素D可通过抑制NF-κB活化,降低抗凋亡蛋白Bcl-xl和Bcl-2表达,诱导白血病细胞凋亡。本课题通过对比研究葫芦素D(cucurbitacin D,Cu D)和葫芦素I(cucurbitacin I,Cu I)对T细胞淋巴瘤细胞的作用,分析其化学结构与抗癌机制的关系,为相关药物开发及T细胞淋巴瘤治疗提供参考。主要研究内容如下:第一部分比较葫芦素D与葫芦素I对小鼠T细胞淋巴瘤EL4细胞增殖的影响及其作用机制目的:比较葫芦素D和葫芦素I对小鼠T细胞淋巴瘤EL4细胞的作用,分析其化学结构与抗癌机制的关系,为相关药物开发及T细胞淋巴瘤治疗提供参考。方法:1小鼠T细胞淋巴瘤EL4细胞在DMEM培养基中常规培养,每24~48小时传代,实验均使用对数期细胞。2 Cell Titer-Glo®荧光细胞活性检测法检测并比较葫芦素D与葫芦素I对小鼠T细胞淋巴瘤EL4细胞增殖的影响:分别用葫芦素D和葫芦素I刺激细胞,观察药物刺激组细胞对细胞形态的影响,Cell Titer-Glo®荧光细胞活性法检测细胞活性。3 Western Blot法检测并比较葫芦素D与葫芦素I对小鼠T细胞淋巴瘤EL4细胞凋亡的影响:葫芦素D与葫芦素刺激EL4细胞,提取细胞总蛋白,Western Blot法检测并比较对照组及葫芦素D、葫芦素I刺激后EL4细胞内凋亡相关蛋白PARP与Caspase-3活化及表达情况。4 Western Blot法检测并比较葫芦素D与葫芦素I在小鼠T细胞淋巴瘤EL4细胞中对NF-κB p65活化的影响:葫芦素D与葫芦素刺激EL4细胞,提取细胞总蛋白,Western Blot法检测并比较对照组及葫芦素D、葫芦素I刺激后EL4细胞内NF-κB p65活化及表达情况。结果:1 Cell Titer-Glo®荧光细胞活性检测法结果显示葫芦素D与葫芦素I对小鼠T细胞淋巴瘤EL4细胞增殖均有抑制作用,作用具有时间-剂量依赖性,且葫芦素I对EL4细胞增殖的抑制作用强于葫芦素D(P<0.05)。2 Western Blot法结果显示葫芦素D与葫芦素I可使小鼠T细胞淋巴瘤EL4细胞内凋亡相关蛋白Cleaved-PARP,Cleaved-caspase-3表达增加,且葫芦素I作用强于葫芦素D(P<0.05)。3葫芦素D与葫芦素I可以抑制NF-κB p65活化,且葫芦素I作用强于葫芦素D(P<0.05)。结论:1葫芦素D与葫芦素I可抑制小鼠T细胞淋巴瘤EL4细胞NF-κB p65磷酸化激活,活化caspase-3和PARP诱导细胞凋亡,抑制细胞增殖。2葫芦素I对EL4细胞抑制作用强于葫芦素D。第二部分 比较葫芦素D与葫芦素I 对人T细胞淋巴瘤细胞株及T细胞淋巴瘤患者和健康志愿者外周血淋巴细胞的影响目的:比较葫芦素D和葫芦素I对人T细胞淋巴瘤Hu T78,Hu T102,MT-2,MT-4细胞,T细胞淋巴瘤患者及健康志愿者外周血淋巴细胞的作用,进一步评价葫芦素D和葫芦素I用于T细胞淋巴瘤治疗的价值。方法:1人T细胞淋巴瘤Hu T78,Hu T102,MT-2,MT-4细胞在DMEM培养基中常规培养,每24~48小时传代,实验均使用对数期细胞。2 Cell Titer-Glo®荧光细胞活性检测法检测并比较葫芦素D与葫芦素I对Hu T78,Hu T102,MT-2,MT-4细胞增殖的影响:分别用葫芦素D和葫芦素I刺激细胞,Cell Titer-Glo®荧光细胞活性法检测细胞活性。3 T细胞淋巴瘤患者及健康志愿者外周血淋巴细胞分离:取T细胞淋巴瘤患者及健康志愿者外周血12~20m L,Lympholyte法分离淋巴细胞。4 Cell Titer-Glo®荧光细胞活性检测法检测并比较葫芦素D与葫芦素I对人外周血淋巴细胞增殖的影响:分别用葫芦素D和葫芦素I刺激细胞,Cell Titer-Glo®荧光细胞活性法检测细胞活性。结果:1葫芦素D与葫芦素I可抑制人T细胞淋巴瘤Hu T78,Hu T102,MT-2,MT-4细胞增殖,且葫芦素I对细胞增殖的抑制作用强于葫芦素D(P<0.05)。2葫芦素D与葫芦素I可抑制T细胞淋巴瘤患者外周血淋巴细胞增殖(P<0.05),而对健康志愿者外周血淋巴细胞无抑制作用(P>0.05)。结论:1葫芦素D与葫芦素I可抑制人T细胞淋巴瘤细胞株Hu T78,Hu T102,MT-2,MT-4及T细胞淋巴瘤患者外周血淋巴细胞增殖,葫芦素I作用强于葫芦素D。2葫芦素D与葫芦素I可抑制T细胞淋巴瘤患者外周血淋巴细胞增殖,而相同浓度刺激对健康志愿者外周血淋巴细胞增殖无抑制作用。第二部分比较葫芦素D与葫芦素I对人T细胞淋巴瘤细胞株及T细胞淋