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心肌肥厚是高血压常见的靶器官损害,同时也是心肌梗死、心衰和猝死的独立危险因素。心肌肥厚常伴有能量代谢障碍。近年来,研究发现心肌能量代谢的改变也参与心肌肥厚的形成。作为心脏能量代谢的主要场所,线粒体在高血压及心肌肥厚中的作用和机制的研究是一个热点问题。同时线粒体还参与信号转导,调控细胞增生、分化及死亡。结合线粒体分离纯化技术,蛋白质组学成为高通量、规模化、整体化研究某一生理或病理状态下线粒体所有蛋白质的有力工具,为从蛋白水平诠释线粒体功能及其在疾病中的作用机制提供新的理论基础和思路。自发性高血压大鼠(SHR)是最常用的高血压模型,其心肌肥厚的发生不仅和机械因素(血压)有关,还和其遗传背景造成的生化因素有关。比较血压升高前后SHR心肌组织的线粒体蛋白质表达将有助于分析该模型致心肌肥厚的病理因素,揭示线粒体在高血压病心肌肥厚的作用和机制。
双向荧光差异凝胶电泳(two dimension difference gel electrophoresis,2D-DIGE)是一种新出现的荧光标记的定量蛋白质组学技术,比经典的双向电泳(2-DE)具有更高的动力学范围和灵敏性,是在蛋白质组水平进行蛋白质表达差异分析的有力工具。我们选取血压正常期(4周龄)和血压升高期(20周龄)的SHR大鼠和年龄与之相匹配的对照WKY大鼠,以及降压药氯沙坦干预8周的28周龄SHR和未处理的28周龄SHR,应用差速离心和不连续密度梯度离心方法抽提左心室组织的线粒体,经2D-DIGE分离蛋白,电泳结果分别用3种不同的激发波长得到不同颜色的荧光信号,根据这些信号的比例来判定样品之间蛋白质的差异。通过制备预制胶,寻找蛋白表达差异点,经基质辅助激光解吸电离-飞行时间-飞行时间质谱(MALDI-TOF-TOF MS)分析鉴定蛋白。
基于2D-DIGE的蛋白质组学结果显示4周龄SHR左室心肌组织线粒体蛋白就已发生改变,此时血压尚未升高,但心肌已出现肥厚。其中共有33个差异点,17个点下调,16个点上调。这种改变在高血压发生后的20周龄SHR的左室心肌中却不明显,甚至部分点的差异发生恢复,提示线粒体的调变早期参与了心肌肥厚的发生。33个差异点中许多被鉴定出是同一种蛋白,提示存在修饰、异构体或基因水平的变化。我们共鉴定出17种蛋白,涉及到线粒体的能量代谢如糖酵解、脂肪酸氧化、三羧酸循环和线粒体氧化磷酸化的多种酶和一些分子伴侣、孔道蛋白,提示SHR左室心肌早期就存在线粒体功能障碍,而这些变化可能通过线粒体能量不足而产生的氧化应激参与了SHR心肌肥厚的发生。药物的短期干预并没有影响差异点的表达。同时我们测定了心肌能量和心功能,结果发现20周龄的SHR心功能要高于同年龄段的WKY大鼠,提示血压升高后,肥厚的心肌早期在压力负荷刺激下心功能出现代偿,甚至是升高,心脏兴奋收缩偶联需要大量的ATP,线粒体为了适应这种变化发生增殖,可能也是部分能量代谢蛋白回复的原因。
这些差异蛋白中,我们发现其中有两个改变比较明显的蛋白,分别是线粒体三功能酶α亚基(Hadha)和NADH还原酶1α亚单位10(Ndufa10)。Hadha是长链脂肪酸β氧化过程中的关键酶,而Ndufa10是呼吸链复合体I的亚基参与了线粒体氧化磷酸化过程,它们都是线粒体能量产生中的重要组分。我们通过蛋白免疫印迹验证了它们在二维电泳的差异表达,并且这种改变在1周龄SHR左室心肌也同样存在,而此周龄段的SHR尚未出现心肌肥厚,提示这些变化是基于SHR大鼠遗传背景的原发性变化。同时我们发现Hadha存在可能的蛋白剪切,且只存在左室心肌中,而Ndufa10的改变在心脏各部分及不同的脏器均出现,这种变化经基因测序被证实为碱基突变,并由此可能伴随蛋白的修饰。
本研究结果显示蛋白质组学作为线粒体研究中的一种重要方法,通过前期线粒体纯化,可以建立更多的线粒体蛋白质表达谱,为筛选疾病相关蛋白质及探测线粒体蛋白修饰状况的改变、确定其修饰位点,寻找相关疾病诊断和治疗的靶标提供有力的工具。上述结果可为进一步探讨线粒体在高血压性心肌肥厚的发病机制提供新的线索。