论文部分内容阅读
本研究通过生物信息学的方法对太平洋牡蛎数据库进行数据筛选和分析，鉴定了几种TLR（Toll样受体，Toll-like receptor）信号通路相关的基因，并运用包括分子克隆、荧光定量PCR、细胞转染、荧光素酶报告基因检测等分子生物学和细胞生物学常用的技术，分析了它们在TLR信号通路中的功能。 首先，采用RACE技术在太平洋牡蛎中获得了两种天然截断型MyD88（髓样细胞分化蛋白88，Myeloid differentiation factor88）基因、IRAK4（白介素-1受体相关激酶4，Interleukin receptor-associated kinase4）基因和一种新的IκB(NF-κB抑制因子，Inhibitor of nuclear factor-kappaB)基因的全长cDNA序列。序列分析结果显示:(1)两个截断型MyD88分子只含有TIR（Toll/IL-1受体结构域，Toll/IL-1R homologous region）结构域而缺失了DD(死亡结构域，DeathDomian)结构，二者紧密串联在同一个scaffold上，暗示它们极有可能源于同一个基因的复制;(2) CgIRAK4 N端有一个DD结构域，C端有一个丝氨酸/苏氨酸激酶结构域;(3) CgIκ B3N端包含有保守的DS30GFCS34序列和五个锚蛋白重复序列(ankyrin repeats，ANKs)，无典型的PEST序列和酪蛋白激酶Ⅱ(CaseinkinaseⅡ，CKⅡ)磷酸化位点。运用实时定量PCR技术检测了这些基因在太平洋牡蛎各个组织的表达水平，表明它们都组成型的表达于太平洋牡蛎的各个组织，且多表达在鳃和淋巴这类承担主要免疫功能的组织。用不同PAMP刺激牡蛎淋巴血细胞后，不同的基因对不同刺激呈现出不同的表达模式，但都有上调趋势，证明了它们跟免疫反应的相关性。在此基础上，还通过在HEK293细胞瞬时转染和双荧光素报告基因检测，检测了它们的过表达对NF-κB活性影响，结果表明:(1) CgMyD88-Ts能抑制全长型CgMyD88激活的NF-κB活性;(2) CgIRAK4则是通过与CgMyD88共同作用，协同正向调控NF-κB活性;(3) CgIκB3过表达时能抑制HEK293细胞中NF-κB/Rel的活性。 研究结果表明，CgMyD88-Ts、CgIRAK4和CgIκB3都在TLR信号通路中参与了NF-κB活性调节。本研究探究了太平洋牡蛎三个关键基因对TLR信号通路的调控作用，为证明TLR信号通路的保守性提供了可靠的分子生物学，也加深了人们对无脊椎动物先天免疫反应的理解和认识。