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猪圆环病毒(Porcinecircovirus，PCV)是迄今为止发现的一种最小的动物病毒，其基因组为单股环状DNA，病毒粒子无囊膜，呈二十面体对称。PCV分为PCV1和PCV2两种基因型。猪圆环病毒病(PCVAD)自二十世纪九十年代初期首次报道以来，美国、法国、日本、韩国等国家相继报道该病的发生，目前该病已成为世界范围内危害严重的疾病之一。PCV2除引起猪体发生原发感染甚至死亡之外，还侵害猪的免疫系统，导致免疫抑制，继发其他的细菌或病毒感染，使疫情加重，给世界养猪业造成了巨大的经济损失。因此，本研究以编码PCV2核衣壳蛋白的ORF2基因为研究对象，以伪狂犬病毒弱毒疫苗株HB98株为亲本毒，构建了表达ORF2和IL-2基因的重组伪狂犬病毒，为探索开发PCV2重组疫苗奠定基础，从而为生产上PCV2的防治提供新的思路和理论依据。
本研究根据GenBank中已发表的PRV基因序列，设计并合成了一对特异性引物，采用PCR方法扩增PRV基因，并将其进行克隆和测序。对伪狂犬病病毒闽A株基因组DNA3.1kb片段的质粒pMD-PD用ShpI和KpnI消化，将含gG全基因及其上游pK基因、下游gD基因部分编码区约2.8kb的片段亚克隆到载体pUC19中，获得重组质粒PUPD。以pcDNA3.1为模板，通过PCR扩增约0.3kb的SV40Poly(A)片段，并将其克隆到质粒PUPDBamHI和PstI位点，构建重组质粒PUPDS。
通过酶切、补平、连接的方法对PUPDS和pEGFP-n1载体质粒进行改造，消除了质粒PUPDS上的HindⅢ酶切位点，将改造后的质粒PUPDS命名为PH。并消除了质粒pEGFP-n1上的BamHI和PstI酶切位点，将改造后的质粒pEGFP-n1命名为pEGFP-P。根据pEGFP-n1基因序列设计一对引物，分别在引物的上、下游5’端引入了PstI酶切位点，以质粒pEGFP-P为模版，通过PCR扩增技术将目的基因EGFP(包括GFP、CMV、MCS、SV40Poly(A))克隆入pMD18-T载体内，构建了重组质粒。经酶切和PCR鉴定证明插入片段是EGFP基因，并将重组质粒命名为pMD-EGFP。用PstI酶切重组质粒pMD-EGFP和载体PH并回收，将载体PH去磷酸化后与目的片断EGFP连接，通过PCR扩增、酶切、序列测定，证实该转移载体构建成功，并将其命名为PG。
用BamHI酶切克隆有ORF2基因的质粒538-ORF2和载体PG质粒并回收，将载体PG去磷酸化后与目的片段ORF2基因连接，构建了重组质粒PGO。通过PCR扩增、酶切、序列测定证明，该转移载体构建成功。经酶切鉴定证明插入片断是ORF2基因片断，并证明插入方向正确。以pIRES-pIL2为模板，通过PCR扩增约0.5kb的猪IL-2全基因，并将其克隆到质粒PGO中，构建重组质粒PGOIL2。然后再将该质粒与PRV基因缺失株HB98株基因组共转染ST细胞，通过同源重组，构建了同时表达PCV2ORF2基因和猪IL-2基因的重组伪狂犬病毒株。经荧光检测和PCR鉴定，结果表明重组病毒构建成功。