雅致枝霉As3.2806(Thamnidiumelegans)是一株可以在低温条件下生长的低等丝状真菌，并具有转化亚油酸生成γ-亚麻酸的能力强，γ-亚麻酸相对含量高而且几乎没有C18：3以上多不饱和脂肪酸等特点。通过多因素条件试验得到液态发酵雅致枝霉产γ-亚麻酸的最佳条件培养基组成为(g/L)：葡萄糖80g，CMC7g，柠檬酸钠2g，NH4NO32.069g，蛋白胨1.042g，20℃，培养六天，菌丝体干重达11.63g/L，脂肪酸含量达45.27％，脂肪酸产量达5.26g/L，其中γ-亚麻酸含量为24.4％其产量达1.28g/L。 为进一步研究雅致枝霉△6-脂肪酸脱氢酶的分子生物学特性，参照真菌来源的△6-脂肪酸脱氢酶保守的氨基酸序列设计简并引物进行RT-PCR，从雅致枝霉的总RNA中获得一个459bp的cDNA片段，编码153个氨基酸。通过其编码的氨基酸序列的相似性搜索表明，所扩增片段为新的潜在的△6-脂肪酸脱氢酶基因的部分cDNA序列。根据获得的部分序列设计基因特异性引物，通过cDNA末端扩增(RACE)技术获得该cDNA的3和5两端序列，从而获得全长为1490bp的cDNA序列。序列分析结果表明该序列具有一个长度为1380bp、编码459个氨基酸的开放阅读框，命名为TED6,所编码蛋白的分子量为52.4KD。将其与已报道的△6-脂肪酸脱氢酶的氨基酸序列进行系统进化分析，△6-脂肪酸脱氢酶可以分为原核、动物、高等植物和低等真核四个类型。可以推测原核类型的△6-脂肪酸脱氢酶是所有△6-脂肪酸脱氢酶的共同祖先，真核类型的△6-脂肪酸脱氢酶在后来的进化中形成更具选择优势的细胞色素b5融合蛋白。动物类型的△6-脂肪酸脱氢酶处于真核类△6-脂肪酸脱氢酶的最基础分枝，其中鱼类的△6-脂肪酸脱氢酶可能是动物类型的△6-脂肪酸脱氢酶通过序列改变向△5-脂肪酸脱氢酶进化的中间过度形式。高等植物和真菌类型的△6-脂肪酸脱氢酶存在着共同起源，藻类和苔藓可能在高等植物和真菌类△6-脂肪酸脱氢酶的进化关系上扮演着重要的角色。此外对雅致枝霉△6-脂肪酸脱氢酶的基因组结构进行了初步的分析，结果表明GTED6中存在四个典型的三类内含子序列，与亲缘关系较近的少根根霉和高山被孢霉的△6-脂肪酸脱氢酶的基因组结构有相近之处，该序列已经注册到NCBI的GenBank中，序列接收号为AY099380。 为了验证所获得序列的功能，把潜在的编码序列TED6亚克隆到表达载体pYES2.0，构建重组表达质粒pYTED6，并转化到酿酒酵母的缺陷型菌株INVScl进行表达。通过气相色谱(GC)和气相色谱/质谱(GC-MS)分析表明，该序列在酿酒酵母中获得表达。所编码的蛋白具有△6-脂肪酸脱氢酶活性，能催化外源性底物亚油酸转化成γ-亚麻酸，γ-亚麻酸的含量占酵母总脂肪酸的7.5％。这是国际上首次报道从雅致枝霉中克隆的△6-脂肪酸脱氢酶基因并在酿酒酵母中进行表达，该基因序列已经注册到NCBI的GenBank中，序列接收号为AY941161。将雅致枝霉△6-脂肪酸脱氢酶基因TED6导入巴斯德毕赤酵母GS115，经甲醇诱导表达，结果表明在转基因酵母细胞PICTED6中产生γ-亚麻酸和C18：2△6、9，分别为6.83％和4.08％。在毕赤酵母中主要存在16、17和18碳的饱和和不饱和脂肪酸，其中C16：1△9，C17：1△9，C18：1△9、C18：3△9，12，15，同时可以作为△6-脂肪酸脱氢酶的内源性潜在的底物，但在转基因酵母细胞中没有检测到C16：2△6，9、C17：2△6，9、C18：4△6，9，12，15的合成，说明雅致枝霉△6-脂肪酸脱氢酶的催化功能具有链长的特异性和键位特异性。在不同温度下培养雅致枝霉，发现其细胞内GLA相对含量明显存在随温度降低而升高的趋势，即低温诱导GLA合成增加。通过同位素Northern杂交试验，发现雅致枝霉△6-脂肪酸脱氢酶基因转录确实受到温度诱导表达调控。 利用嵌套引物、降落PCR和反向PCR技术，成功扩增出已知雅致枝霉△6-脂肪酸脱氢酶基因的旁侧序列，经测序得到5上游1.3Kb，3下游2.3Kb，分别与已知序列有132bp和122bp重叠区，并进行了PCR检测，结果正确。将获得的5上游区序列与已知的脂肪酸脱氢酶基因启动子中所具有的转录元件进行对比分析，发现该上游序列中具有潜在的丝状真菌“核心”启动子成分，转录激活因子FSE-2串联重复区，CCAAT，AP-1，STRE等多种脂肪酸脱氢酶基因启动子调控蛋白结合元件。为验证该序列的启动子功能，利用引物步移法获得5上游不同区段缺失序列，并连接到启动子探针型载体pAJN161中进行功能分析。实验结果表明，该序列在大肠杆菌和酿酒酵母中都具有启始转录功能，表明已克隆到的5上游1.3Kb序列中具有雅致枝霉△6-脂肪酸脱氢酶基因启动子成分，该基因序列已经注册到NCBI的GenBank中，序列接收号为DQ309425。