在工业发酵过程中,微生物经常暴露于各种环境应激源中,如热、酸碱性、氧化、渗透刺激等,其中热胁迫是影响微生物生长代谢的最重要因素之一,它对发酵培养基组分的溶解度、代谢途径中酶的催化效率和生化过程的反应速率都有很大的影响。而且,极端温度也会破坏细胞膜结构或干扰蛋白质和RNA等生物大分子的功能,从而破坏细胞的完整性,降低细胞活力和发酵能力。谷氨酸棒状杆菌是氨基酸和有机酸生物技术生产的重要工业成员,在发酵生产过程中伴随着环境温度上升,导致其生产性能下降。因此,为了实现高效的高温发酵,筛选和开发具有理想耐热性状的稳健菌株具有重要的意义。本研究试图开发耐热的谷氨酸棒杆菌进化菌株,通过过表达来自谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌、极端嗜热菌、短乳杆菌的相关抗逆调控因子和分子伴侣,筛选出具有耐高温能力的功能元件。采用适应性实验室进化策略,分离出两株对高温抗性提高的菌株,通过基因组分析得到所有突变靶点,并进行高温生长测试。最后对携带阳性靶点的突变菌株进行转录组分析,挖掘谷氨酸棒杆菌对高温胁迫耐受性的抗逆机制。主要研究内容和结果如下:（1）确定筛选元件的温度胁迫。分别在30°C、32°C、35°C、37°C、40°C、42°C、43°C条件下培养20 h,测试谷氨酸棒杆菌的在不同温度胁迫下的生物量,最终确定42°C作为耐高温元件筛选的最佳温度。（2）耐高温元件的筛选。共构建来自谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌、极端嗜热菌、短乳杆菌39个具有潜在耐高温能力的元件,包括转录调节因子、分子伴侣、热激蛋白等,并在谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）ATCC13032中表达,42°C条件下培养20 h,通过生物量测试筛选,得到对高温耐受性增强的元件hsp Q、G6、G9,在添加IPTG诱导时,与对照菌株相比,其对42°C高温耐受性分别提高约17.5%、25.1%、20.3%。（3）适应性实验室进化。选择谷氨酸棒杆菌ATCC13032作为亲本菌株,进行热应激条件下的适应性实验室进化。通过连续的摇瓶培养,进化出了两个独立的样本HTMevol-1和HTMevol-2,经过适应后,最终从热应激筛选板中分离出两个耐热性最好的个体菌落WHT4和WHT59,在32°C和42°C条件下对这两个耐热菌株进行为期28 h的生长曲线测试和在30°C至43°C温度范围内进行生长测试,结果表明,WHT4和WHT59菌株的生物量为野生型菌株的2.5倍和2.4倍,进化得到的菌株均表现出良好的耐热能力。为了研究适应菌株的遗传突变,对实验室保存的亲本菌株谷氨酸棒杆菌ATCC13032和2株热进化菌株WHT4和WHT59进行全基因组重测序,结果表明,与未进化的亲本菌株相比,进化的菌株存在13个错义基因突变和3个同义基因突变。进一步的研究表明,一些基因的错义点突变,特别是fas R-L102F和hrc A-L119P,与野生型菌株相比,高温耐受性分别提高38.4%和18.3%。通过谷氨酸棒杆菌fas R-L102F和hrc A-L119P阳性突变组合表达和在基因组上的敲除高温测试结果表明,阳性突变组合表达菌株对高温耐受性提高55.6%,?hrc A和?fas R的高温耐受性分别提高22.6%和61.7%。因此,fas R-L102F和hrc A-L119P是谷氨酸棒杆菌改良获得耐热性的重要靶点。（4）耐高温机制分析。通过转录组GO富集分析得知hrc A-L119P、fas R-L102F突变菌株在ATP能量代谢、核苷酸代谢、肽代谢、氧化还原过程、膜转运蛋白活性等多个生物过程来提高耐热性;KEGG通路富集表明,hrc A-L119P突变菌株在RNA降解、磷酸肌醇代谢、碳代谢等途径相关基因的表达水平较对照菌株有显著的变化,fas R-L102F突变菌株在糖酵解、磷酸肌醇代谢、ABC转运体、丙烷酸代谢、丙烷酸代谢途径相关差异表达基因显著上调,这些通路的变化可能增强谷氨酸棒杆菌耐热性。综上所述,这些发现有助于我们了解谷氨酸棒杆菌的耐热性机制,并为菌株改良获得耐热性提供新的胁迫相关靶点。