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[目的]华法林是临床应用十分广泛的抗凝药物,其引起的心脏瓣膜钙化已成为临床上严重的并发症,但缺乏早期检测和有效治疗方法,而华法林应用的时长与主动脉瓣钙化程度密切相关,目前对于其机制的研究尚不充分。既往认为转录因子SOX5(SRY-related HMG-box 5,SOX5)主要参与胚胎发育、细胞周期及软骨形成的调控,近年来SOX5被发现可能参与成骨分化及主动脉瓣膜间质细胞的钙化,但在华法林引起的心脏瓣膜钙化中的作用尚未见报道。本研究旨在探究转录因子SOX5在华法林诱导的主动脉瓣钙化病变中的作用,将为揭示瓣膜钙化的机制提供新的理论依据,并可能为临床开发防治钙化的新药物提供线索。[方法]1.SOX5在钙化性人主动脉瓣膜和华法林诱导钙化的小鼠主动脉瓣膜的表达采用免疫荧光染色和实时荧光定量PCR(real time polymerase chain reactions,RT-PCR)检测瓣膜功能不全患者的非钙化主动脉瓣膜组织、接受长期华法林治疗的风湿性心脏瓣膜病(rheumatic heart disease,RHD)患者的钙化主动脉瓣膜组织、正常小鼠及华法林诱导的钙化小鼠的主动脉瓣膜中SOX5的表达量。2.过表达及敲低SOX5对华法林诱导的主动脉瓣膜间质细胞(aortic valve interstitial cells,AVICs)钙化的影响体外分离培养猪的AVICs,采用腺病毒介导的Ad-SOX(过表达)及Ad-shSOX5(敲低)感染AVICs,过表达SOX5以及敲低SOX5,后予华法林1.0μmol/L 诱导 AVICs 钙化,通过钙含量检测、ALP(Alkaline Phosphatase,ALP)活性检测和茜素红染色明确SOX5在钙化中的作用。收集RNA和蛋白进行RT-PCR和 Western Blot 检测钙化相关基因 RUNX2(Runt-related transcription factor 2,RUNX2)、SOX9(SRY-related HMG-box 9,SOX9)、BMP2(Bone Morphogenetic Protein 2,BMP2)Bone Morphogenetic Protein 2,BMP2)表达变化。3.钙化的AVICs中SOX5与抗钙化因子SOX9在核内的表达变化收集钙化后的核蛋白进行Westernblot检测核内外SOX5、SOX9和ATF4的表达变化。免疫荧光染色检测SOX5和SOX9在AVICs钙化时的表达。4.SOX5与抗钙化因子SOX9的相互作用通过蛋白质免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)和 Duo-link PLA 原位蛋白互作技术探究SOX5的转录复合物。通过染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,Ch-IP)对分离纯化的DNA进行Ch-IP验证,探究SOX5对SOX9基因启动子区域的作用。[结果]1.SOX5在钙化性人主动脉瓣膜和华法林诱导钙化的小鼠主动脉瓣膜中的表达RT-PCR和免疫荧光染色证实SOX5高表达在人AVICs中,并在接受长期华法林治疗的RHD患者的钙化主动脉瓣膜组织中表达下调60%以上(p<0.05);免疫荧光染色证实SOX5在华法林皮下注射构建的小鼠钙化模型中表达量显著下降。2.过表达及敲低SOX5对华法林诱导的主动脉瓣膜间质细胞(aortic valve interstitial cells,AVICs)钙化的作用细胞内钙含量测定、茜素红染色等钙化表型检测发现,与对照组相比,过表达SOX5明显降低了华法林诱导的AVICs的钙沉积和ALP活性(p<0.001)。Western Blot检测显示过表达SOX5后华法林诱导的AVICs中RUNX2较对照组下降25%(p<0.001),SOX9较对照组升高4倍(p<0.001)。RT-PCR显示钙化相关标志物BMP2、RUNX2明显降低(p<0.001),SOX9明显升高(p<0.001)。干扰SOX5的表达后,细胞内钙含量测定、茜素红染色等钙化表型检测发现华法林诱导的AVICs的钙沉积增多,ALP活性在干扰SOX5后较对照组升高2倍(p<0.01)。Western Blot检测显示干扰SOX5后华法林诱导的AVICs中RUNX2较对照组升高1.2倍(p<0.05),SOX9较对照组降低50%(p<0.01)。3.钙化的AVICs中SOX5与抗钙化因子SOX9在核内的表达变化在核蛋白水平,华法林诱导钙化的AVICs中,SOX9表达量降低28%(p<0.05),过表达SOX5后SOX9升高到初始水平(p<0.05)。免疫荧光染色表明过表达SOX5后,SOX9在核内表达明显增多。4.SOX5与SOX9的相互作用Co-IP结果表明SOX5直接与SOX9结合,且在钙化时结合增多。Duo-link PLA证实SOX5直接与SOX9结合,在钙化时结合增多,且在核内结合增多更加显著。Ch-IP证实SOX5增加了 SOX9基因启动子区域的活性(p<0.001)。[结论]1.转录因子SOX5通过抑制AVIC的成骨样分化显著抑制华法林诱导的主动脉瓣钙化。2.在AVICs中SOX5可直接与SOX9结合形成复合物,阻止SOX9向核外转运,同时增加了 SOX9基因启动子区域的活性,促进SOX9的表达,从而抑制华法林诱导的AVICs钙化。