转录因子SOX5抑制华法林诱导的主动脉瓣钙化的机制研究

来源 :南京医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:canble_dut
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
[目的]华法林是临床应用十分广泛的抗凝药物,其引起的心脏瓣膜钙化已成为临床上严重的并发症,但缺乏早期检测和有效治疗方法,而华法林应用的时长与主动脉瓣钙化程度密切相关,目前对于其机制的研究尚不充分。既往认为转录因子SOX5(SRY-related HMG-box 5,SOX5)主要参与胚胎发育、细胞周期及软骨形成的调控,近年来SOX5被发现可能参与成骨分化及主动脉瓣膜间质细胞的钙化,但在华法林引起的心脏瓣膜钙化中的作用尚未见报道。本研究旨在探究转录因子SOX5在华法林诱导的主动脉瓣钙化病变中的作用,将为揭示瓣膜钙化的机制提供新的理论依据,并可能为临床开发防治钙化的新药物提供线索。[方法]1.SOX5在钙化性人主动脉瓣膜和华法林诱导钙化的小鼠主动脉瓣膜的表达采用免疫荧光染色和实时荧光定量PCR(real time polymerase chain reactions,RT-PCR)检测瓣膜功能不全患者的非钙化主动脉瓣膜组织、接受长期华法林治疗的风湿性心脏瓣膜病(rheumatic heart disease,RHD)患者的钙化主动脉瓣膜组织、正常小鼠及华法林诱导的钙化小鼠的主动脉瓣膜中SOX5的表达量。2.过表达及敲低SOX5对华法林诱导的主动脉瓣膜间质细胞(aortic valve interstitial cells,AVICs)钙化的影响体外分离培养猪的AVICs,采用腺病毒介导的Ad-SOX(过表达)及Ad-shSOX5(敲低)感染AVICs,过表达SOX5以及敲低SOX5,后予华法林1.0μmol/L 诱导 AVICs 钙化,通过钙含量检测、ALP(Alkaline Phosphatase,ALP)活性检测和茜素红染色明确SOX5在钙化中的作用。收集RNA和蛋白进行RT-PCR和 Western Blot 检测钙化相关基因 RUNX2(Runt-related transcription factor 2,RUNX2)、SOX9(SRY-related HMG-box 9,SOX9)、BMP2(Bone Morphogenetic Protein 2,BMP2)Bone Morphogenetic Protein 2,BMP2)表达变化。3.钙化的AVICs中SOX5与抗钙化因子SOX9在核内的表达变化收集钙化后的核蛋白进行Westernblot检测核内外SOX5、SOX9和ATF4的表达变化。免疫荧光染色检测SOX5和SOX9在AVICs钙化时的表达。4.SOX5与抗钙化因子SOX9的相互作用通过蛋白质免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)和 Duo-link PLA 原位蛋白互作技术探究SOX5的转录复合物。通过染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,Ch-IP)对分离纯化的DNA进行Ch-IP验证,探究SOX5对SOX9基因启动子区域的作用。[结果]1.SOX5在钙化性人主动脉瓣膜和华法林诱导钙化的小鼠主动脉瓣膜中的表达RT-PCR和免疫荧光染色证实SOX5高表达在人AVICs中,并在接受长期华法林治疗的RHD患者的钙化主动脉瓣膜组织中表达下调60%以上(p<0.05);免疫荧光染色证实SOX5在华法林皮下注射构建的小鼠钙化模型中表达量显著下降。2.过表达及敲低SOX5对华法林诱导的主动脉瓣膜间质细胞(aortic valve interstitial cells,AVICs)钙化的作用细胞内钙含量测定、茜素红染色等钙化表型检测发现,与对照组相比,过表达SOX5明显降低了华法林诱导的AVICs的钙沉积和ALP活性(p<0.001)。Western Blot检测显示过表达SOX5后华法林诱导的AVICs中RUNX2较对照组下降25%(p<0.001),SOX9较对照组升高4倍(p<0.001)。RT-PCR显示钙化相关标志物BMP2、RUNX2明显降低(p<0.001),SOX9明显升高(p<0.001)。干扰SOX5的表达后,细胞内钙含量测定、茜素红染色等钙化表型检测发现华法林诱导的AVICs的钙沉积增多,ALP活性在干扰SOX5后较对照组升高2倍(p<0.01)。Western Blot检测显示干扰SOX5后华法林诱导的AVICs中RUNX2较对照组升高1.2倍(p<0.05),SOX9较对照组降低50%(p<0.01)。3.钙化的AVICs中SOX5与抗钙化因子SOX9在核内的表达变化在核蛋白水平,华法林诱导钙化的AVICs中,SOX9表达量降低28%(p<0.05),过表达SOX5后SOX9升高到初始水平(p<0.05)。免疫荧光染色表明过表达SOX5后,SOX9在核内表达明显增多。4.SOX5与SOX9的相互作用Co-IP结果表明SOX5直接与SOX9结合,且在钙化时结合增多。Duo-link PLA证实SOX5直接与SOX9结合,在钙化时结合增多,且在核内结合增多更加显著。Ch-IP证实SOX5增加了 SOX9基因启动子区域的活性(p<0.001)。[结论]1.转录因子SOX5通过抑制AVIC的成骨样分化显著抑制华法林诱导的主动脉瓣钙化。2.在AVICs中SOX5可直接与SOX9结合形成复合物,阻止SOX9向核外转运,同时增加了 SOX9基因启动子区域的活性,促进SOX9的表达,从而抑制华法林诱导的AVICs钙化。
其他文献
肉鸡传染性腺胃炎在当今肉鸡养殖行业中属于高发和多发疾病,由于该病的发病原因和发病机制尚不明确,给临床防治带来了极大的困难,也给肉鸡养殖带来严重的经济损失。本试验通
环L-苯丙氨酸L-脯氨酸(cyclo-(L-Pro-L-Phe),cFP)是一种非常重要的天然产物,已在多种细菌和真菌的次生代谢产物中被报道。国内外研究已发现cFP具有抗真菌、抗细菌、抗病毒和
Log Structured Merge Trees(LSM-tree)作为一种写优化的存储结构被广泛地应用于现代存储引擎的设计中。LSM-tree为了提高写性能,将写操作以日志的形式缓存于内存,延迟写入磁
扫描天线在雷达和通信领域有广泛的应用。传统的波束扫描天线采用机械扫描的方式,其稳定性差且成形速度慢,而新型电扫描波束天线可以分成相位扫描和频率扫描两种形式,前者一般应用于高要求的军事领域,但大功耗、高成本等限制其在民用方面的发展;后者有着体积小、成本低的优势,更加适合于民用。论文结合频率扫描天线扫描原理和分形理论,设计出一种新型的基于分形的宽带频率扫描天线。将分形结构用于微带阵列天线中,利用其结构
中国东南部季风区,因水热条件较好,植被茂密,树木生长对气候的响应较为复杂,同时强烈的人类活动对树木生长干扰较大,东南地区找到老龄树又有一定的难度,导致该地区的树轮气候
近些年,无线通信领域对数据传输性能有了更高的要求,多输入多输出(Multiple-Input Multiple-Output,MIMO)技术作为该领域的关键技术,一直是研究的热点。MIMO系统的收发信号在时间、空间、频率等维度上形成的高维阵列信号在使用传统的矢量或矩阵等方式建模时会有局限性,而采用张量(tensor)的方式建模高维数据的研究越来越受到关注。目前已有一些文献针对不同无线传输系统提出多
关于股东会决议的瑕疵界定、效力评价以及有关的救济措施,被合称为股东会决议瑕疵制度。该制度历来有“二分法”与“三分法”这两种立法模式。依据我国现行《公司法》的规定,
合成孔径雷达(Synthetic Aperture Radar,SAR)是一种主动式微波传感器,是工作在微波波段的相干波成像雷达,它不受环境、气候和时间等因素的影响并且具有超强的穿透能力,广泛
目的:观察扶正通络针法治疗气血不足型顽固性面瘫的临床疗效及安全性。方法:以气血不足型顽固性面瘫患者为观察对象,按照纳入标准筛选患者,根据患者的就诊先后顺序用随机数字
船舶保险潜在缺陷条款自出现以来,一直未有相关法律或者合同上的规定对潜在缺陷的具体含义进行明确解释。围绕着如何认定船舶保险中的潜在缺陷问题产生的纠纷时常出现。英国