论文部分内容阅读
小麦赤霉病(Fusarium head blight,FHB)在全球范围内广泛发生,它大多由禾谷镰刀菌复合群(Fusarihwgraminearum species complex)产生,不仅导致农作物产量和品质的下降,还会产生多种真菌毒素,如脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)和玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN),导致人、畜中毒,机体免疫功能降低,致癌、致畸和致突变。由于传统的抗性育种实验繁琐且耗时长,化学药剂又存在残留及耐药性风险,会对环境产生不利影响,所以环境友好型生物防治法逐渐成为治理小麦赤霉病的研究重点。本研究以解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amylolie)MQ01为研究对象,进行拮抗禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)和降解ZEN毒素的研究。本文研究了菌株Bacillus amyloliquefaciens MQ01的生长特性。采用单因素实验对MQ01的生长条件进行了优化,结果显示:MQ01的最适生长温度为30℃,最适生长pH为6.0,在250mL三角瓶中,当装液量≤100mL时,生长旺盛,最适碳源为葡萄糖,最适氮源为蛋白胨。为了研究Bacillus amyloliquefaciens MQ01拮抗禾谷镰刀菌及降解玉米赤霉烯酮毒素的机制,需要构建菌株MQ01的突变子文库。由于菌株MQ01为野生型芽孢杆菌,用于芽孢杆菌随机突变的携带转座子TnYLB-1的穿梭载体pMarA较大,因此转化有很大的难度。本研究中首先尝试了传统的Spizizen化学法进行转化，旦是没有成功。后面改用电转方法,成功地将质粒pMarA转入到菌株MQ01中。考虑到转化效率较低,优化了电转条件。优化后的电转化条件为:制备感受态细胞时,MQ01的浓度控制在OD600= 0.9～1.0,转化电压为2.0 KV,优化后的转化效率达到1.94～2.60×10-8。在高温诱导条件下,进行了转座子插入突变,将穿梭载体pMarA上转座子TnYLB-1随机插入到菌株MQ01中,构建了菌株MQ01的突变体文库,获得5000多个阳性克隆。研究了菌株MQ01对禾谷镰刀菌的拮抗机制,通过拮抗功能的测定从MQ01的随机突变文库中筛选出了五个丧失拮抗禾谷镰刀菌活性的突变株,并从突变株中克隆了转座子侧翼序列,在MQ01全基因组测序结果的基础上,推测出5个和拮抗相关的基因序列:cytochrome p450、peptide 8、peptidase M4、subtilisin、chitin binding protein。通过把拮抗基因连接到表达载体pET-32a上,转入E.coliBL21(DE3)中进行表达,结果subtilisin基因成功表达,并具有拮抗活性。MQ01除了能够对禾谷镰刀菌具有拮抗作用,对禾谷镰刀菌产生的玉米赤霉烯酮(ZEN)也具有降解作用。为了有足够的底物ZEN用于研究MQ01降解ZEN特性,首先研究了玉米赤霉烯酮的制备、提取工艺及检测技术。确定了 ZEN高产菌株76F-25;烘干磨粉毒素提取效率较高;采用硅胶柱、薄层层析法纯化和葡聚糖凝胶柱的方法获得了纯度在95%以上的ZEN晶体;明确了液相色谱和液质联用的检测方法。采用液相色谱检测ZEN的含量发现菌株MQ01在7天内对ZEN的降解率达到90%以上。MQ01对ZEN的降解特性结果显示:菌株MQ01能很好地降解5～625 μg/mL的ZEN;MQ01降解ZEN的最适温度是30℃,最适pH值为6.0～8.0,在250mL三角瓶中装液量为25～100mL 时,通气量对MQ01降解ZEN没有显著影响,但是装液量大于125mL时,降解率会随着装液量的增加而下降。通过ZEN降解能力的检测,从构建的MQ01的突变子文库中筛选到了 5株丧失降解ZEN效果的突变株,具体的降解机制还需进一步研究。