蛋白质谷氨酰胺酶能够直接催化大分子蛋白质脱酰胺,而不需要先对蛋白质进行水解,其脱酰胺过程也不会引起蛋白质结构的不良变化;且蛋白质谷氨酰胺酶的特异性高,只作用于蛋白质侧链的谷氨酰胺,而不能使天冬酰胺脱酰胺。通过蛋白质谷氨酰胺酶的作用,蛋白质的二级结构中的利于蛋白质改变的柔性结构的成分增加,使得蛋白质的溶解度增加,进一步的也改善了蛋白质功能特性,如乳化性、起泡性等,由此扩大了蛋白质在食品工业中的应用。因此,蛋白质谷氨酰胺酶被称为最具有潜力的蛋白质改性工具。目前国内外对蛋白质谷氨酰胺酶的研究主要以其应用为主,对产蛋白质谷氨酰胺酶菌株的报道较少。华东师范大学微生物实验室经过5年从中国九个不同省份土样中筛选得到45株产蛋白质谷氨酰胺酶菌株,其中33株解朊金黄杆菌为食品用安全菌株。但是这些从土壤样品中筛选到的野生型菌株发酵后的蛋白质谷氨酰胺酶产量较低,不能将这些菌株直接应用于工业生产,需要通过一定的方法对菌株进行诱变,以提高其蛋白质谷氨酰胺酶产量。本研究选取两株野生型菌株为亲本,利用原生质体融合技术进行多轮递推式融合,最终获得蛋白质谷氨酰胺酶高产融合菌株,主要研究结果如下:1.原生质体融合出发菌株的确定以33株解朊金黄杆菌野生菌株建立育种出发菌菌种库,利用全自动核糖体分型将33株解朊金黄杆菌分为三大类,将33株解朊金黄杆菌发酵测定其蛋白质谷氨酰胺酶酶活,结果表明,L11酶活最高,Y8在优化前后的培养基中的酶活表现最稳定。结合之前的全自动核糖体分型及土样来源分析,最终确定来自四川绵阳的分型为I类的Y8和来自上海青浦的分型为Ⅲ类的L11为原生质体融合的亲本。2.原生质体融合实验条件的确定本研究首次将原生质体融合技术应用于蛋白质谷氨酰胺酶高产菌株的选育,经优化最终确定的实验条件为:将菌液稀释至OD600为2.00,加入0.1 mol/L EDTA和0.1%SDS至EDTA的终浓度为0.008 mol/L、SDS的终浓度为0.002%进行预处理,然后重悬至含有25 mg/mL Sigma溶菌酶的SMM Buffer中进行处理获得原生质体。得到两株亲本的原生质体悬液分别在距离15 W的紫外灯30 cm处灭活3 min和60℃水浴热灭活2 min,取等体积两种不同方式灭活的原生质体悬液混合后离心去上清,加入融合剂于20℃ 200 r/min振荡融合40 min。涂布再生培养基挑取并筛选长出的融合子。在此实验条件下,原生质体的形成率为91.19%±3.56%、再生率为66.53%±2.71%、纯度为85.87%±1.18%、融合率为1.52%±0.22%。3.四轮递推式原生质体融合选育高产菌株以野生菌株Y8和L11为亲本进行第四轮递推式原生质体融合,四轮共计通过48孔板初筛共计初筛11233株菌,经过48孔板、试管和摇瓶三种体系复筛,四轮高产菌株较该轮出发菌株酶活最高分别提高31.51%、19.12%、18.96%和21.32%。最终得到的1株高产菌株命名为PF-Y0448,该菌株经传代10次,其蛋白质谷氨酰胺酶酶活平均值为1.14±0.09 U/mL,较野生型菌株Y8和L1 1最高能提高143%～175%。4.高产菌株特性分析生长产酶曲线结果表明,L11和PF-Y0448的对数生长期为4h-12h,生长8h后开始产酶,L11在19 h时酶活最高,PF-Y0448产酶的最高点略早于L11,在发酵第16 h。两株菌在发酵第24 h时的单位菌体量酶活达到最大值。对高产菌株的碳源、氮源利用分析结果表明,在不同的碳源和氮源条件下,蛋白质谷氨酰胺酶酶活不同,其中以5 g/L的乳糖为碳源、15 g/L的多聚蛋白胨为氮源时酶活最高。在发酵培养基补加实验中发现,发酵培养基以0.3 g/L葡萄糖为碳源,当葡萄糖消耗完后添加5g/L的乳糖有助于提高蛋白质谷氨酰胺酶酶活。5.L11和PF-Y0448生物信息学分析为初步探究菌株蛋白质谷氨酰胺酶的高产机制,本研究利用第三代测序技术对L11进行全基因组测序,其中编码蛋白质谷氨酰胺酶的基因位于ORF03588,根据Softberry启动子预测结果可知,ORF03588和ORF03589在同一操纵子,由同一启动子调控完成某项生物学功能,但是ORF03589的功能还不明确,需要进一步的探究。以L11为参考序列利用第二代测序技术对PF-Y0448进行重测序,筛选其SNP和InDel并进行功能注释,结果表明,PF-Y0448上的SNP主要被归类为碳水化合物运输与代谢、无机离子迁移和代谢、氨基酸转运和代谢、核苷酸苷酸代谢及酪氨酸代谢相关。PF-Y0448上InDel插入突变序列为假想蛋白,暂不能确定其功能。由于对测序结果的挖掘尚不够深入,无法将分析结果与蛋白质谷氨酰胺酶酶活进行关联,因此尚无法得出可能的高产原因。但本研究首次对该菌株进行全基因组分析,为后续深入了解菌株遗传特性以及定向育种研究奠定了基础。