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血吸虫病广泛流行于非洲、亚洲和南美,是仅次于疟疾的一种寄生虫病。血吸虫病的长期防控依赖于高效疫苗的应用。目前国际上公认的具有较高保护力效果的疫苗是辐照致弱的尾蚴/童虫疫苗(RAV),但由于材料来源困难、安全性等问题,不能大规模使用。因此,需要通过研究RAV模型的高保护性效应机制来研发出高效、安全的抗血吸虫分子疫苗。研究发现RAV模型可诱导宿主产生高水平的以Th1为优势应答的高保护力,其原因可能是辐照后虫体损伤严重,移行缓慢,长期滞留在肺部并伴随大量虫源性分子的释放,引起宿主较强的免疫反应。高迁移率族蛋白(HMGB1)是一种核蛋白,在电离辐射条件下可从核内迁移至胞外。已有研究表明曼氏血吸虫HMGB1可诱导宿主巨噬细胞释放大量的致炎细胞因子,是引发宿主炎症反应的关键分子。因此推测日本血吸虫HMGB1(SjHMGB1)作为虫源性的应激分子在RAV诱导的高保护力中发挥了类似的重要作用。本研究旨在探索SjHMGB1在活化宿主免疫细胞,调节免疫反应上的功能。为进一步阐明SjHMGB1在RAV中发挥的作用奠定基础。1、分析SjHMGB1在辐照与正常虫体细胞上的表达情况。体外培养不同期别的辐照和正常童虫,用胰酶消化成单个细胞。流式细胞术检测结果显示SjHMGB1在辐照早期4 d时的表达量明显高于正常组,7 d时显著下降低于正常组(P<0.01),10 d、14 d两者无显著差异;RT-PCR检测SjHMGB1的mRNA的转录水平发现辐照组在4 d、7 d显著高于正常组(P<0.01),在10 d时两组无显著差异。初步推断SjHMGB1在辐照童虫早期大量表达释放。2、分析reSjHMGB1诱导致敏小鼠淋巴细胞的反应。reSjHMGB1蛋白刺激致敏小鼠淋巴细胞48h后,MTT法检测淋巴细胞增殖、流式细胞术检测淋巴细胞亚群状况以及胞内细胞因子的表达情况。结果显示该蛋白能够显著的刺激致敏小鼠淋巴细胞增殖(SI>2);蛋白免疫组CD4+/CD8+T细胞的比值为2.28显著高于对照组的1.76(P<0.01),且胞内IFN-?的表达量显著增加(P<0.01)。提示SjHMGB1蛋白可诱导小鼠产生Th1型免疫应答。3、分析reSjHMGB1在调节宿主固有免疫中的作用。reSjHMGB1与RAW264.7细胞共孵育48 h,通过流式细胞术检测细胞表面分子、ELISA检测胞外细胞因子。结果表明reSjHMGB1刺激组与对照组相比,RAW264.7细胞表面Toll受体4(TLR4)受体上调表达,差异极显著(P<0.01),而Toll受体2(TLR2)受体下调表达(P<0.05),同时胞外TNF-α和NO的分泌量显著增加(P<0.01)。提示SjHMGB1可通过TLR4通路诱导巨噬细胞向致炎性的M1型巨噬细胞分化。4、研究reSjHMGB1诱导宿主树突状细胞(DC)功能成熟。reSjHMGB1刺激分选后的DC 48 h后再与CD4+T细胞共孵育168 h,流式细胞术检测DC表面分子、胞内细胞因子和T细胞增殖情况,ELISA检测胞外细胞因子分泌情况。结果表明reSjHMGB1刺激组DC细胞表面的趋化因子受体CCR7和CXCR4显著上调表达(P<0.01),同时胞外TNF-α,IFN-?,IL-4的含量显著增加(P<0.01)。reSjHMGB1蛋白与DC和CD4+T共孵育实验结果表明,CD4+T释放IFN-?显著增加(P<0.01)。提示SjHMGB1促进DC功能成熟,活化CD4+T细胞,诱导Th1型免疫应答。5、初步探索reSjHMGB1活化嗜中性粒细胞的功能。蛋白刺激嗜中性粒细胞4 h后,通过显微镜观察嗜中性粒细胞胞外陷阱(NETs)的形成,RT-PCR检测细胞因子的mRNA转录水平。实验结果表明蛋白刺激后可观察到明显的NETs现象,且与对照组相比MMP-9,MCP-1,CCL-3和CXCL-2的mRNA转录水平显著提高(P<0.01)。提示SjHMGB1能够刺激嗜中性粒细胞向炎症表型分化。综上所述,本研究发现SjHMGB1在辐照童虫早期大量表达及释放,能够活化巨噬细胞、促进DC功能成熟、活化CD4+T细胞并诱导其向Th1型分化。初步探索了SjHMGB1刺激嗜中性粒细胞胞外陷阱形成的过程。为进一步阐明SjHMGB1在RAV模型中所发挥的作用和机制奠定了基础。