【摘 要】
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随着养殖业规模持续扩大,羽毛作为家禽的副产物的大量堆积不仅造成环境破坏、病原微生物滋生,还会造成角蛋白资源的严重浪费。本研究采用条件温和、工艺环保的微生物法降解羽
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随着养殖业规模持续扩大,羽毛作为家禽的副产物的大量堆积不仅造成环境破坏、病原微生物滋生,还会造成角蛋白资源的严重浪费。本研究采用条件温和、工艺环保的微生物法降解羽毛角蛋白,利用液体发酵法探究菌株降解羽毛的最优化条件,并对角蛋白酶基因进行克隆,进一步在大肠杆菌系统中进行融合表达,拟实现角蛋白酶的外源表达。1.以羽毛为唯一碳、氮源筛选到一株高效降解角蛋白的菌株海水芽孢杆菌Bacillus aquimaris JM7。对Bacillus aquimaris JM7以羽毛为底物的发酵条件进行了单因素及正交试验优化,实验结果显示:Bacillus aquimaris JM7降解羽毛最适发酵条件为:培养基初始pH值为9.0;菌接种量4%(v/v);培养温度40℃;摇床转速150rpm;羽毛粉添加量为0.2%(m/v);额外添加氮源及蔗糖对菌株降解羽毛粉均有抑制作用。上述条件下培养30h后,羽毛粉降解率达74.5%,高于多数文献报道水平。Bacillus aquimaris JM7降解羽毛主要产生谷氨酸、丝氨酸、脯氨酸等17种氨基酸。2.对角蛋白酶基因Ker02562进行了克隆、表达和纯化。采用PCR技术扩增了角蛋白酶基因,其全长为963 bp,编码了一个由320个氨基酸残基组成、预计分子量为34.181kDa的蛋白质。构建了重组表达质粒并转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达,SDS-PAGE分析表明,重组角蛋白酶E.coli-pCold I-Ker02562的分子量为38kDa左右(角蛋白酶34kDa,pCold I自身标签4kD左右),和预测分子量一致。3.对纯化后的角蛋白酶酶学性质研究结果表明:(1)酶的最适反应温度为40℃,在10-50℃条件下热稳定性良好;最适pH为7.0-10.0,该条件下酶能保持90%以上的活性;(2)金属离子Ca2+,Fe2+,Sr2+对酶活具有促进作用;(3)浓度为5mM的PMSF和1mM、5mM的EDTA对酶活有抑制作用,说明该酶为丝氨酸蛋白酶,其活性中心可能含有金属离子;(4)有机溶剂DMSO、异丙醇和乙腈对酶活均有抑制作用,浓度越高,抑制作用越大。
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