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羊支原体性肺炎（Mycoplasmal pneumonia of sheep and goats,MPSG）是在羊群中普遍流行的以纤维素性肺炎和胸膜炎为主要特征的接触性传染病,其主要是由丝状支原体山羊亚种（Mycoplasma mycoides subsp.Capri,Mmc）、绵羊肺炎支原体（Mycoplasma ovipneumoniae,Mo）和山羊支原体山羊亚种（Mycoplasma capricolum subsp.Capricolum,Mcc）等支原体引起。本研究前期调查资料显示,贵州省该病病原以Mo和Mmc两种病原为主,且死亡率呈不断上升趋势,给养羊业带来严重的经济损失,且MPSG综合防控面临诸多困难。本研究应用分子克隆技术、生物信息学技术以及基因工程技术对Mo贵州分离株P113蛋白基因和Mmc贵州分离株LppA蛋白基因进行研究,以期寻找有效的防控MPSG的新型疫苗和完善的防控技术,为本病的早期检测、免疫效果评价及新型疫苗研究提供基础研究资料。1.Mo P113/Mmc LppA蛋白基因克隆及生物信息学分析:根据Gen Bank公布的Mmc LppA和Mo SC01菌株基因序列信息,设计合成特异性引物,应用PCR、分子克隆和生物信息学技术对Mo贵州分离株P113蛋白基因和Mmc贵州分离株LppA蛋白基因进行克隆测序和生物信息学分析。结果显示,Mo贵州株（GZ-QX1）P113基因全长3240bp,可编码1079个氨基酸;Mmc贵州株（GZ-DF1）LppA基因全长1572bp,可编码523个氨基酸。Mo GZ-QX1分离株P113基因序列与Mo Y98参考株同源性达99.9%,而与其他种属羊肺炎支原体间同源性低于39.4%;Mmc GZ-DF1 LppA基因与标准株PG3同源性同源性达100%,而与其他种属羊肺炎支原体间同源性低于72.8%。实验结果表明,Mo贵州分离株P113蛋白基因和Mmc贵州分离株LppA蛋白基因高度保守,不同种属支原体间差异大,不存在交叉免疫效果。生物信息学分析认为Mo P113/Mmc LppA蛋白整体抗原性较好,含有较多的优势抗原表位结构,其中Mo P113蛋白C末端抗原性优势明显,Mmc LppA蛋白N末端抗原性优势明显,可作为蛋白免疫学研究的靶标蛋白区段。2.Mo P113/Mmc LppA蛋白原核表达及间接ELISA方法的建立:以Mo P113/Mmc LppA基因序列为模板,应用PCR方法扩增优势抗原表位基因片段,并克隆至表达载体p Cold I,构建重组原核表达质粒;转化表达宿主菌诱导表达目的蛋白,并建立基于目的蛋白的间接ELISA方法。结果显示,成功构建含Mo P113和Mmc LppA基因的重组原核表达质粒p ColdⅠ-P113、p ColdⅠ-LppA;转化宿主菌诱导表达,SDS-PAGE和Western-Blotting检测显示表达蛋白分子量分别为33KDa和23KDa;其中P113蛋白最佳诱导表达条件为28℃0.8 mmol/L IPTG诱导3h,LppA蛋白最佳诱导表达条件为30℃0.8 mmol/L IPTG诱导3h,且纯化蛋白具有较好的抗原反应原性。基于纯化表达蛋白建立的间接ELISA方法最佳反应条件为:Mo P113包被蛋白浓度为1.5μg/100μL,血清稀释度1:100,封闭液为1%明胶,封闭时间为1 h,临界值为2.325;Mmc LppA包被蛋白浓度为2.0μg/100μL,血清稀释度1:50,封闭液为3%BSA,封闭时间为1 h,临界值为2.738;ELISA方法性能评价显示其具有较好的特异性和重复性,可用于Mo P113/Mmc LppA蛋白特异性血清抗体的检测。3.Mo P113/Mmc LppA蛋白真核表达及免疫研究:应用PCR方法扩增Mo P113/Mmc LppA基因片段并克隆至表达载体p VAX1,构建重组真核重组质粒并转染至MDBK细胞。应用PCR技术及间接免疫荧光试验评价其体外表达效果;通过间接ELISA、MTT淋巴细胞增殖试验、组织病理学技术、流式细胞术、免疫保护试验等方法分析重组质粒诱导免疫BABL/C小鼠体液免疫应答和细胞免疫应答情况。结果显示,成功构建含Mo P113/Mmc LppA基因重组真核表达质粒p VAX1-P113、p VAX1-LppA以及p VAX1-P113-LppA,重组质粒转染MDBK细胞能有效转录m RNA并表达目的蛋白。动物免疫实验显示,重组质粒都能诱导小鼠产生特异性的血清抗体,其OD630值较对照组有大幅度上升的趋势,实验后期趋于平稳,表明重组质粒能诱导机体产生较强的体液免疫应答,其中p VAX1-P113（100μg）组和p VAX1-LppA（100μg）组OD630平均值分别最高;免疫小鼠血清细胞因子测定结果显示,重组质粒组分泌产生的IL-2、IL-4及IFN-γ细胞因子均高于对照组,表明重组质粒可诱导小鼠产生良好的细胞免疫应答反应;应用流式细胞术对试验小鼠CD4+T细胞和CD8+T细胞百分比进行分析,结果表明重组质粒诱导了Th1/Th2型免疫,但以Th1型免疫为主;攻毒试验显示所构建的质粒p VAX1-P113、p VAX1-LppA以及p VAX1-P113-LppA安全性好,且能提供有效的免疫保护,重组质粒组小鼠肺炎症状减轻或症状不明显。上述结果表明,Mo P113/Mmc LppA蛋白基因具有较高保守性和较好抗原性,其中Mo P113蛋白C末端抗原性优势明显,Mmc LppA蛋白N末端抗原性优势明显。通过构建p ColdⅠ-P113和p ColdⅠ-LppA重组质粒获得的目的蛋白具有较好的抗原性;基于目的蛋白建立的间接ELISA方法具有较好的特异性和可重复性。构建的真核表达质粒p VAX1-P113、p VAX1-LppA以及p VAX1-P113-LppA能诱导小鼠产生良好的体液免疫和细胞免疫应答反应,且能提供有效的免疫保护作用。研究结果为Mo/Mmc所致MPSG综合防控提供新思路、新技术,为新型疫苗可行性研究提供理论基础。