H5N1亚型高致病性禽流感(H5N1-Highly Pathogenic Avian Influenza，H5N1-HPAI)是由正粘病毒科A型流感病毒引起严重性传染病，国际兽医局(OIE)曾将该病列为A类烈性传染病，现在则列为必须报告的传染病(notifiable disease)。AIV的基因组由8条单股负链RNA组成，NS基因是流感病毒的第8节段基因。2000年以来，H5N1亚型禽流感病毒在NS基因的第263～277位出现15个碱基的缺失(即80～84位5 aa缺失)，学者们通过序列比对发现有15碱基缺失的H5N1亚型禽流感病毒逐渐成为流行株中的优势群体，该缺失的生物学意义尚未进行深入研究。对于H5N1亚型AIV的NS1蛋白的致病性位点已有不少的研究，有报道认为NS1蛋白92Glu、97Glu是流感病毒高致病性的关键。为了研究NS1蛋白80～84、92和97位氨基酸位点这3个因素对H5N1亚型AIV生长特性及致病力的相互影响，本研究利用禽流感病毒反向遗传技术，构建了7个基因同源而NS基因引入不同突变的一系列突变病毒，并测定了这些突变病毒在不同细胞上的生长特性和对非免疫鸡和小鼠的致病力，以揭示H5N1亚型AIV这三个因素的生物学意义。 1.NS基因第263～277位核苷酸缺失对H5N1亚型禽流感病毒在细胞上竞争生长能力的影响 本实验以NS基因263～277位未缺失的AIV重组毒株248和人工缺失该区域的突变株m248为研究对象。248和m248的其他7个基因同源：HA和NA源自一株H5N1病毒，5个内部基因同源自WSN(H1N1)毒株。 将这两株病毒以103个PFU混合，然后分别在MDCK、COS-1、Vero和CEF上连续传10代。提取第0、1、5、10代病毒RNA，通过RT-PCR扩增出NS基因，并将其连接到T载体进行克隆。用菌落多重PCR方法来检测各个代次下248和m248所占的比例。在第1代病毒中，这两个病毒在4个繁殖体系中的所占的比例相差不大；在第5、10代病毒中，与不能产生干扰素的细胞系(Vero)相比，在能产生干扰素的细胞系(MDCK、CEF)上，m248所占的比例显著高于248。这表明NS基因15nt的缺失后的病毒在能产生IFN的细胞系中获得了更强的繁殖性能，同时证实了该区域的缺失可以提高病毒的抗干扰素的能力。但是在COS-1细胞系中m248所占比例与Vero相比并没有显著差异，推测这可能与COS-1产生IFN能力较弱有关。 2.H5N1亚型AIV的NS1蛋白第80～84、92、97位氨基酸与病毒生物学特性和致病性的关系 本实验对NS1蛋白80～84、92、97位氨基酸位点进行了一系列的突变，并利用反向遗传技术获得突变病毒。通过6个重组病毒的体外生长实验发现，NS1蛋白第80～84缺失及92Glu和97Asp都会提高病毒在细胞中的繁殖能力，并且其中任何两处在提高病毒的繁殖能力上都呈现出协同作用。16个重组病毒的生物学特性比较结果表明，D92E和D97E的突变株对小鼠、试验鸡和鸡胚的致病力明显增强。而80～84缺失虽然会提高病毒对鸡胚和小鼠的毒力，但是并没有提高病毒对非免疫鸡的致病性，推测可能是因为非免疫鸡的体质比SPF鸡好，重组病毒的毒力差异在非免疫鸡上可能反映的不明显。研究还发现重组病毒能诱导小鼠产生较高的抗体水平，能保护小鼠抵抗致死性感染。通过预测分析各个突变株的NS1蛋白三维结构发现，D92E只是稍微降低了NS1蛋白N末端发生折叠的可能性，并没有引起蛋白的亲水性、抗原性和表面活性的变化。 全文小结： 1、NS基因第263-277位核苷酸缺失后的突变株在能产生干扰素IFN的细胞(MDCK和CEF)上的增值能力显著高于未发生缺失的同源株，说明缺失突变株的抗IFN能力明显增强。 2、研究发现，NS1蛋白80～84氨基酸缺失及D92E和E97D的突变都会提高病毒在细胞中的繁殖能力，并且任何两方面在提高病毒的繁殖能力上都有协同能力。 3、进一步证实了，80-84位缺失、92Glu、97Glu位都能提高重组病毒对小鼠的毒力。 4、研究发现，以人源的流感病毒为内部基因的重组AIV能诱发小鼠产生很高的抗体水平。