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谷氨酰胺合成酶(GS; EC 6.3.1.2)是植物N素同化途径中最为关键的催化酶之一,被称为是植物中无机态N转化为有机态N的“门户”,对植物N素吸收、同化和利用效率(Nitrogen use efficiency)有着极为重要的影响。高等植物中的GS同工酶主要分为两类:胞质型GS1主要同化从土壤吸收的初级氨及再同化从植物体内各个N循环途径所释放的氨;质体型GS2同化由NO3--N还原而来及光呼吸过程所释放的氨。N素供应对甜瓜的生长发育、果实的产量和品质形成有非常重要的影响,目前甜瓜N素代谢研究还停留在N营养生理与果实品质及产量层面,在分子机理水平的研究报道很少,尤其是对与N素同化和利用效率紧密相关的GS酶基因的研究还是空白。因此,本文以甜瓜作为对象,在从甜瓜中克隆出首个胞质型GS基因M-GS1的基础上,对M-GS1及课题组克隆到的首个甜瓜质体型GS基因M-GS2的基因组拷贝数、表达产物的亚细胞定位及生化特性、在甜瓜中的表达调控特征等进行了研究和对比分析,从基因、蛋白质和细胞水平对甜瓜GS基因进行了系统的功能验证和鉴定,开展了甜瓜N营养代谢的分子生理研究;进而在植株水平研究M-GS1在转基因超量表达后提高植株N素同化效率的潜能,为甜瓜GS基因的应用、利用GS基因改良植物N素利用效率的研究提供新的材料和依据。主要研究结果如下。1、甜瓜胞质型谷氨酰胺合成酶基因的克隆及生物信息学分析本研究采用RACE-PCR方法从甜瓜(Cucumis melo L. var. reticulatus Naud.)品种“春丽”中克隆出首个GS1基因M-GS1(GenBank登录号: DQ851867)的全长cDNA序列,并利用生物信息学手段分析其主要结构和功能特征。该基因全长1494 bp,含一个1068 bp的开放阅读框(ORF),推测编码一个由356个氨基酸残基组成的多肽。氨基酸序列比对结果显示,M-GS1与源自其它植物的GS1有较高的同源性;氨基酸序列分析显示该蛋白具有植物GS同工酶的典型结构特征:内含一个GS beta-Grasp域和一个GS catalytic域,以及分别存在于这两个域中的两个活性中心(motif)——一个GS指纹区和一个GS ATP结合区。对M-GS1三级立体结构的预测分析显示,它与通过X光衍射鉴定的晶体GS结构一致,其立体结构的正确折叠需要有Mn2+、AMP及Citric acid等3个配体的存在。系统进化树分析表明,M-GS1与北美假大麻(Datisca glomerata)GS1在分子进化关系上最相近,提示二者可能是同源进化的结果。2、甜瓜谷氨酰胺合成酶基因的基因组拷贝数对M-GS1及课题组克隆到的首个甜瓜质体型GS基因M-GS2(GenBank登录号: AY773090)在甜瓜基因组中的拷贝数进行了对比分析。Southern blot结果显示,在甜瓜基因组中,M-GS1可能被一个由2到3个基因成员组成的基因家族所编码,而M-GS2则由单个基因编码。3、甜瓜谷氨酰胺合成酶的亚细胞定位通过将甜瓜M-GS1及M-GS2基因分别与报告基因——黄色荧光蛋白YFP基因融合,构建重组植物表达载体(pA7-GS1::YFP和pA7-GS2::YFP),应用基因枪法转入洋葱内表皮细胞中进行瞬时表达,然后在激光扫描共聚焦显微镜下,对表达产物在洋葱内表皮细胞内的分布情况进行了观察和分析。结果显示,融合蛋白M-GS1::YFP定位于洋葱内表皮细胞的细胞质中,而融合蛋白M-GS2::YFP则定位于洋葱内表皮细胞的质体中。这些结果在细胞水平证实了甜瓜M-GS1和M-GS2蛋白确实具有其自身所属同工酶类别(GS1或GS2)通常所应具有的亚细胞定位特性。4、甜瓜谷氨酰胺合成酶基因的原核表达及产物GS酶活性相关分析为了对甜瓜M-GS1及M-GS2各自所编码的GS酶的生化功能和属性有准确的了解,本实验分别对M-GS1编码区、M-GS2编码区及去除跨肽cTP序列的M-GS2编码区(M-GS2-cTP)成功地进行了原核表达,用Ni–NTA亲和色谱法纯化得到了各对应的重组蛋白。SDS-PAGE电泳结果显示,重组M-GS1、M-GS2和M-GS2-cTP蛋白的分子量分别为41 kDa、50 kDa和44 kDa。分析各重组蛋白质的谷氨酰胺合成酶催化特性显示,只有重组M-GS1蛋白质和重组M-GS2-cTP蛋白质具有GS酶催化活性,而未切除cTP序列的重组M-GS2蛋白质无GS催化活性;M-GS1比M-GS2-cTP具有更高的NH4+亲和性和GS酶合成酶活性,但其热稳定性相对更低;两种甜瓜GS酶的活性明显受Mg2+浓度的调节。这些结果进一步在蛋白质水平证实M-GS1和M-GS2为谷氨酰胺合成酶基因,而它们的表达产物具有各自不同的生化特性。5、不同形态N营养施养处理对甜瓜中谷氨酰胺合成酶基因表达的调控用实时荧光定量PCR方法,分析不同形态N素施养处理对甜瓜M-GS1及M-GS2表达的潜在调控作用。结果显示,不同形态的N素施养处理对甜瓜中M-GS1及M-GS2的表达呈现不同的调节模式。NH4+-N和NO3--N中、低浓度(3.75 mM或0.75 mM)施养处理仅对甜瓜叶片中M-GS2的表达有显著的调节作用;足量的N素营养浓度水平(7.5 mM)施养处理则对M-GS2表达量无明显调节作用。然而,谷氨酸施养处理,不仅调节M-GS2在叶片中的表达(开始降低而后升高到一个比对照高的水平),还调节其在根中的表达;对甜瓜根中M-GS1表达产生抑制作用,对其在叶片和茎中的表达则无明显影响。NH4+-N施养处理能刺激M-GS1基因在甜瓜苗根、茎、叶中的表达,而NO3--N则仅刺激其在甜瓜根和叶中的表达。以上结果表明,正是由于不同的GS同工酶基因有不同的表达调节特性,具有差异化的生理功能,才能保证植物在应对现实生长环境中不断变化的N营养供应状况时其N素同化作用得以正常进行。6、甜瓜M-GS1转基因超量表达对拟南芥N相关生理生化的影响将甜瓜M-GS1基因正确构建于植物表达载体pEZT-NL中,获得含目的基因的植物表达载体EHA105-35S::M-GS1::EGFP。在根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105的介导下,通过浸花法(Floral-dip)再将构建的植物表达载体转入拟南芥。通过除草剂筛选及基因组DNA PCR验证,获得了十个独立的转M-GS1基因株系。提取独立转基因株系总RNA进行RT-PCR分析,结果显示,M-GS1在各独立转基因株系中均检测到了表达。正常(7 mM)及低N素(1mM)水平培养实验发现,转M-GS1基因对植株生长生化指标的影响只在低N素水平培养时显著表现。生化及生长分析显示,在低N素供应时,各M-GS1转基因株系莲座叶(rosette)的总GS酶活性、总可溶性蛋白含量和生物量均显著地高于野生型拟南芥植株。这些结果表明,M-GS1基因的超量表达具有在低N素供应环境下维持转基因植株N素同化利用效率的潜能。