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研究目的结核病是当今全球范围内对人类最具威胁的传染性疾病之一。追踪传染源和查证传播途径是长期困扰传统结核病流行病学的一个问题,也是分子流行病学首要解决的问题。为了评价分枝杆菌基因分型技术在结核病预防控制方面的应用价值,本研究选择15个结核病高发县作为监测哨点,建立结核病暴发流行监测预警系统,以MIRU技术为首选分型法对培养阳性菌株进行监测性基因分型,组建结核病分子流行病学数据库,研究基因型分布与结核病传播流行规律的关系,观察MIRU技术对结核病控制项目的有效实施产生的促进作用。材料和方法选择15个县市作为监测哨点,开展结核病监测工作。在每个哨点采用整群抽样的方法选取结核病例及其接触者,获得人口统计学、社会行为学和医学资料;标本进行细菌学和分子生物学检测并冷藏保存,所有信息输入计算机,建立完备的数据库系统。对抗酸杆菌阳性标本使用酸性罗氏培养基进行分枝杆菌分离培养,当有分枝杆菌生长时,将菌株与病例信息一起送往山东省结核病参比实验室。所有的菌株都采用比例法在鸡蛋培养基上进行抗结核药物敏感性试验.药物临界浓度:异烟肼(INH)为0.2mg/L,链霉素(SM)为4mg/L,利福平(RFP)为40mg/L,乙胺丁醇(EMB)为2mg/L。接种菌量10-2mg和10-4mg。最终接种菌量为10-4mg和10-6mg。耐药判断标准为1%。参照经典方法提取分枝杆菌DNA,留出部分DNA稀释后用于PCR扩增,其余DNA保存在-70℃冰箱。MIRU共有12个位点,使用不同的引物序列分别进行扩增。12个MIRU位点的等位基因位置、重复序列大小以及扩增引物的合成,参考有关文献进行。反应物质包括0.6μl DNA标本,0.15μl Taq DNA多聚酶,21.0μl双蒸水,3.0μl 10×PCR Buffer,4.8μl 1.25mM dNTP,以及正反向引物各0.225μl,总反应体积是30μl。使用GeneAmp9700 PCR扩增仪进行扩增,除外MIRU24位点,其他所有位点的循环条件:95℃预热15分钟:95℃30秒、65℃30秒、72℃30秒,共35个循环:最后72℃延伸7分钟。MIRU24位点的反应需要1×Q溶液,复性温度为55℃。扩增产物使用含1μg/ml EB的2.5%琼脂糖胶在1×TBE缓冲液中电泳,使用100bp DNA Ladder做标志。使用凝胶成像分析仪对电泳结果分析,根据扩增产物的大小判断相应MIRU位点的拷贝数。12个MIRU位点的拷贝数按顺序组成一个12位数字,称为该标本的MIRU基因型。根据基因型是否相同,判断菌株是成簇还是独特型。对全部基因型数字化的结果行聚类分析,与流行病学信息结合后,计算结核病的传播指数,根据成簇率的差别计算近期传播危险因素的比值比。结果2005年7月1日至2006年6月30日选例期间,15个监测哨点共登记肺结核病人1471例,共收集肺结核病患者菌株617株。其中,598株属结核分枝杆菌复合群,另外19株(3.1%)属非结核分枝杆菌,528株结核分枝杆菌经提取DNA后获得了MIRU基因型结果。528株菌株分离自528个结核病人,其中男性382人,女性146人,平均年龄46.4岁(范围17~89,中值为42岁)。敏感株490株,耐药株108株,总耐药率为18.1%。初治组558例,其中耐药94例,原发性耐药率16.8%(95%可信限为14.8%~18.6%);复治组40例,其中耐药14例,获得性耐药率35.0%(95%可信限为27.7%~42.3%)。获得性耐药率明显高于原发性耐药,差异有非常显著性(x2=126.8,P<0.001)。不同年龄及性别间耐药率基本一致。初治组对INH、SM、RFP和EMB 4种药物的耐药率分别为11.5%、11.2%、4.3%和1.2%,复治组则分别为15%、28%、15%和8%。在初治组,108株耐药分离株中63.9%(69/108)对单一药物耐药。原发和获得性MDR分别为3.8%和12.5%。在初治病例和复治病例之间,对4种药物的每1种耐药率差异都有非常显著性(P<0.01)。12个MIRU位点的基因多态性:12个MIRU位点中,位点26显示多态性最高,h为0.59:位点31,10,39,40,4显示中等程度的多态性(h≥10.30),分别为;位点27,16,23,2,20显示较低多态性(h≤0.30),分别为;位点24只有一种等位基因。MIRU基因分型法的分辨率:在本研究中,MIRU基因分型法的分辨率HGDI为0.90.528株结核分枝杆菌菌株通过MIRU方法共被分为140种不同的基因型。成簇的菌株453株,簇的范围为2~164,最大的簇包含164株菌株,基因型为223325173533。讨论和结论本研究起始耐药的结果(耐药率18.1%)与我国1990年和2000年的结果(耐药率分别为28%和18.8%)相比,耐药结核病有下降趋势,证明我国的结核病控制规划是成功的。但仍处于发展中国家的中等水平,与其它国家尤其是发达国家(耐药率5%左右)的结核病耐药情况相比,差距还很大,耐药水平偏高。由此提示我们应进一步加强结核病控制工作,强化直接督导下的短程化疗方案,在强化规范治疗的基础上减少耐药病例的出现。MIRU技术是基于PCR扩增反应的分枝杆菌基因分型技术,只需对DNA的12个MIRU位点分别进行扩增即可得到结果。已有文献把MIRU技术与其他分枝杆菌基因分型技术,如RFLP—IS6110、Spoligotyping等,进行了比较。MIRU具有目前基于PCR扩增的基因分型技术的所有优点:快速,不需要高质量的DNA,分辨率高,数字化的结果易于分析等。本研究对MIRU的12个位点全部进行了扩增,扩增产物使用2.5%琼脂糖胶电泳,经EB染色后使用凝胶成像分析仪判读结果,简便易行。MIRU的12个位点在基因分型中并不具有同等的功效。在本研究中,MIRU的2、23和24位点分别只出现了2、2和1的拷贝数。其他文献同样报道此3个位点的多态性变化较小。如表2.所示,MIRU4、10、26、31、39位点的分辨能力较高。本研究只对来自15个哨点县的528例菌株进行了分型,是造成较高成簇率的主要原因。通过相关结核病危险因素分析发现,新发和无空洞肺结核病例的菌株成簇率明显高于其他因素。此发现说明新近感染发病者和那些症状轻微的肺结核患者更有可能是近期结核菌传播造成的,因为某一基因型的成簇率较高,表明了结核病的传播和流行是存在的,且可能有规模性的暴发。本研究是山东省结核病监测系统的一部分,将持续进行。基于人群样本的分子流行病学研究是一项长期的工作,除收集样本、试验检测、数据处理之外,重要的是进行病例随访、流行病学调查和多因素系统分析。本报告只对部分标本进行试验获得的初步数据进行了分析,相应的流行病学调查正在进行。