植物细胞质雄性不育（cytoplasmic male steriltiy，CMS）是一种不能产生有活力花粉的遗传现象，属母性遗传，在植物杂种优势利用中具有重要价值。棉花细胞质雄性不育机理的相关研究报道不是很多，同玉米、水稻等作物雄性不育机理研究相比，要远远落后。因此，开展棉花细胞质雄性不育的分子机理研究，便于更好的利用棉花杂种优势，具有重要的理论和实践意义。哈克尼西棉（Gossypum harknessii Brandegee）细胞质雄性不育是由细胞质基因控制的并可被核恢复基因抑制的性状，其花药在造孢细胞增殖期就开始退化，并在花粉母细胞减数分裂时期达败育高峰，进而花粉母细胞不能形成四分体，是一种无花粉粒的雄性不育。这种雄性细胞退化早、败育过程清晰和凋亡彻底的花药，既是杂交棉制种的有利条件，也是雄性不育机理研究的良好材料。为此，本文以哈克尼西棉雄性不育系和保持系花药为材料，通过比较花药线粒体超微结构、与CMS相关的线粒体基因序列及基因表达、线粒体代谢酶类的生化分析、线粒体活性氧代谢变化及活性氧清除酶基因的表达，寻找与棉花细胞质雄性不育相关的基因，并探讨细胞质雄性不育产生的可能的分子机理。研究主要结果如下：1．通过对棉花不育系和保持系不同发育时期花药的超微结构观察，发现不育系花药在造孢细胞增殖期，线粒体就已出现异常，表现为轻微肿胀，出现电子透明区。在小孢子母细胞形成期普遍表现出线粒体体积膨胀、内嵴模糊、线粒体空泡化、基质淡化等异常现象，进入减数分裂时期后，线粒体、液泡等细胞器逐渐解体、消失。在不育系小孢子发育不同时期观察到无嵴或嵴不发达乃至空泡化的线粒体，这些线粒体不能行使正常代谢功能，以致ATP产生受到限制，能量供应不足，最终导致花粉败育。所以，线粒体的结构异常是棉花细胞质雄性不育系小孢子败育的重要细胞学特征。2．通过同源克隆方法，在棉花不育系和保持系线粒体基因组中克隆与CMS相关的线粒体基因，发现线粒体atp6、atp9、nad3、nad6、nad9、cob、coxⅠ和coxⅡ基因片段的核苷酸序列在不育系和保持系中没有差异，但是线粒体基因coxⅢ在不育系和保持系中存在碱基突变。不育系和保持系线粒体coxⅢ基因全部编码序列大小没有差异，都为798bp，但序列内部有5个碱基发生了突变，其中3个碱基突变造成编码的氨基酸发生了变异。与保持系相比，不育系coxⅢ基因编码区的A¹⁸⁴、C²⁵⁵、A³⁶⁶、C⁴⁴²和G⁵¹⁶分别被替换为C、T、C、A和C。根据核苷酸序列推导棉花coxⅢ基因编码265个氨基酸。不育系coxⅢ基因推导的氨基酸Ser⁶²、Lys¹²²、Thr¹⁴⁸分别被Arg、Asn和Asn替代，而Ser⁸⁵和Leu¹⁷²因存在密码子简并现象未发生变化，不育系在coxⅢ基因上既发生了错义突变又发生了无义突变。经同源性分析，发现棉花不育系coxⅢ基因的核苷酸序列，与拟南芥、油菜、烟草和玉米等coxⅢ基因的核苷酸序列相比，它们的序列同源性都高达95％。利用RT-PCR和荧光定量RT-PCR方法研究上述与CMS相关的线粒体基因的表达时，发现在整个花药发育过程中，与CMS相关的线粒体基因在不育系中的表达量总体上要低于保持系。在花药败育高峰期（花粉母细胞减数分裂期），与CMS相关的线粒体基因在不育系花药中的表达量要显著低于保持系。3．通过对不育系和保持系叶片、花药细胞色素氧化酶的活性和同工酶活性测定，以及细胞色素氧化酶的细胞化学定位分析，发现不育系和保持系叶片细胞色素氧化酶的活性和同工酶活性没有明显差异，而在花药组织中存在显著差异。在花药败育初期（造孢细胞增殖期），不育系花药中细胞色素氧化酶活性、同工酶活性和线粒体膜上嗜锇颗粒的数量与对应的保持系没有显著差异。在花药败育高峰期，不育系花药细胞色素氧化酶活性和同工酶活性要显著低于保持系花药，不育系花药线粒体膜和嵴上嗜锇颗粒的数量要明显少于保持系花药。在花药败育后期，不育系花药细胞色素氧化酶的活性同保持系相比差异不显著。棉花不育系细胞色素氧化酶活性的降低可能与小孢子的败育和雄性不育的发生有重要联系。4．通过测定不育系、保持系和杂种F₁叶片、花药及其线粒体活性氧含量、活性氧清除酶的活性，以及抗氧化酶基因的表达分析，发现叶片活性氧的含量和活性氧清除酶的活性在不育系、保持系和杂种F₁中没有显著差异。在花药败育初期，不育系花药中活性氧含量稍高于保持系，活性氧清除酶的活性和抗氧化酶基因的表达水平与保持系没有明显差异。但在花药败育高峰期，不育系花药一方面活性氧含量极显著高，另一方面活性氧清除酶活性和抗氧化酶基因的表达水平极显著低，活性氧代谢平衡被打破，造成过量活性氧的积累，产生氧应激，对细胞发育产生毒害。在花药败育过程中，杂种F₁不同于不育系，始终与保持系一样保持正常的活性氧含量和稳定的抗氧化酶转录表达水平。当恢复基因导入不育系后，杂种F₁花药中过量产生的活性氧能得到清除，这可能是由于核恢复基因对棉花花药活性氧产生与清除的动态平衡具有调控作用。综上所述，提出哈克尼西棉细胞质雄性不育的可能的机理，即线粒体呼吸链代谢coxⅢ基因的突变和线粒体结构异常，使线粒体电子传递途径不畅，造成花药中ROS大量产生。由于可育花药和叶片等其他组织具有较高的活性氧清除酶的活性，另外叶片等其他组织对活性氧的敏感程度不如花药雄性细胞（花粉母细胞），所以可育花药和叶片等其他组织中活性氧水平能保持正常，可育花药和叶片等其他组织能够正常发育。而在不育花药中，线粒体活性氧的大量产生，同时线粒体抗氧化酶的活性和基因表达水平显著降低，细胞质中活性氧清除酶的活性在花药败育阶段也很低，导致不育花药细胞大量产生的活性氧不能得到及时、有效的清除，过量的活性氧积累。由于活性氧代谢的失衡和过量活性氧积累所产生的毒性，造成不育花药花粉母细胞大量死亡，从而最终导致花药的败育。