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研究背景: 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)是一种螺旋状、微需氧革兰阴性杆菌,主要定植于胃粘膜,已造成全球50%以上人口感染。研究发现,H.pylori感染所诱导的胃部免疫抑制性微环境发挥了抑制宿主免疫清除细菌效应,进而促进了H.pylori感染相关胃病的进展。H.pylori感染是慢性胃炎、消化性溃疡等疾病的重要致病因子,已被WHO列为I类致癌因子。 我们前期研究发现,H.pylori 可以诱导胃上皮细胞内一种生物活性多肽——肾上腺髓质素(Adrenomedullin, ADM)表达增高。肾上腺髓质素是一个由52个氨基酸组成的生物活性肽,由Kitamura等人在1993年从嗜铬细胞瘤中分离出来,ADM已经被证明可以作为胃肠道上皮细胞生长因子,加速胃肠道粘膜溃疡的愈合,在粘膜保护中发挥重要作用。ADM 具有抑制胃酸分泌,调节肠内糖转运,调节结肠内水和离子转运,调节结肠和小肠运动,提高内皮屏障功能,稳定循环等功能。同时,它又是抗菌肽,通过参与粘膜宿主防御系统,调节胃肠道微生物菌群。阐明H.pylori与ADM的关系,有助于进一步了解 H.pylori感染对胃部微环境的改变和相关疾病进程的影响,并为H.pylori的感染和其相关胃病的防治提供理论依据和实验支撑。 研究目的: 1. 明确胃内幽门螺杆菌感染对ADM表达的影响; 2. 确定幽门螺杆菌感染诱导ADM表达的细胞类型; 3. 探讨幽门螺杆菌感染诱导ADM表达的机制; 4. 探究ADM在胃内发挥的免疫调节作用及其分子机制。 研究方法: 1. 胃内幽门螺杆菌感染对ADM表达的影响 收集人胃粘膜组织标本,提取组织DNA,经实时定量PCR检测H.pylori 16s亚基、cagA的表达,结合尿素酶结果,将标本分为H.pylori未感染组、cagA+H.pylori感染组和cagA-H.pylori感染组,再提取组织RNA,逆转录后经RT-PCR检测ADM表达情况,分析不同人群中H.pylori感染情况下ADM表达水平;SPF级C57小鼠分别用WT H.pylori和△cagA H.pylori菌液灌胃处理,建立H.pylori体内感染小鼠模型,分离胃组织,提取RNA,经RT-PCR检测ADM的表达,并通过免疫组织化学染色检测ADM表达部位和强度;取人胃粘膜组织,用H.pylori刺激,建立H.pylori体外组织感染模型,分别通过RT-PCR和Western blot检测mRNA水平和蛋白水平ADM的表达。 2. 幽门螺杆菌诱导胃上皮细胞ADM表达 用H.pylori 11637菌株和H.pylori 26695菌株分别刺激AGS和HGC-27胃上皮细胞系,建立H.pylori体外细胞感染模型,通过RT-PCR和Western Blot,确定ADM在胃上皮细胞中的表达情况;分选人原代胃上皮细胞,构建H.pylori体外细胞感染模型,检测ADM表达。 3. 幽门螺杆菌诱导胃上皮细胞ADM表达的调控机制 利用信号通路抑制剂Wortmannin等处理AGS细胞,经H.pylori刺激后,检测ADM表达,筛选出调控ADM表达的信号通路;检测H.pylori体外细胞感染模型中AGS细胞的P-AKT表达变化,确定PI3K/AKT信号通路激活情况。 4. 胃内ADM发挥的免疫调节作用及其分子机制 分离分选人原代 CD3+淋巴细胞,经 ADM 刺激,利用流式细胞技术检测其增殖和IFN-γ的表达情况;利用免疫组织荧光双染检测CD3与IFN-γ、ADM的特异性受体结构RAMP2的表达定位情况;分选人原代CD3+淋巴细胞,通过信号通路筛选模型,用信号通路抑制剂处理后,经ADM刺激,利用流式细胞技术检测细胞的增殖和IFN-γ的表达情况,并利用Western blot检测PI3K/AKT和STAT3信号通路激活情况。 研究结果: 1. 胃内幽门螺杆菌感染对ADM表达的影响 H.pylori感染的患者胃组织内ADM的表达较未感染者显著升高,其中cagA-H.pylori感染的患者胃组织内ADM表达低于cagA+H.pylori感染组,说明H.pylori可诱导胃粘膜组织ADM表达升高,并且cagA在其中发挥了一定的作用;H.pylori在体内感染小鼠,使小鼠胃组织 ADM 的表达在感染后 2-4 周显著升高,且免疫组织化学染色结果显示ADM的表达升高位于粘膜基底层;H.pylori体外感染人胃粘膜组织24 h后,可使组织中ADM表达显著升高(约2-3倍),与体内感染结果一致。 2. 幽门螺杆菌可诱导胃上皮细胞ADM的表达 H.pylori 11637和H.pylori 26695体外感染胃上皮AGS和HGC-27细胞系,均能够使AGS和HGC-27细胞中ADM的mRNA表达升高,蛋白表达结果与mRNA表达一致,并且在AGS细胞中ADM的表达呈现感染时间和感染剂量依赖性。H.pylori感染原代胃上皮细胞时,WT H.pylori 能使原代胃上皮细胞中 ADM 表达升高约 2 倍,而△cagA H.pylori则只能使胃上皮细胞ADM表达升高约1.5倍。说明H.pylori可诱导胃上皮细胞中ADM表达升高,且cagA在其中扮演了重要角色。 3. 幽门螺杆菌诱导胃上皮细胞ADM表达的调控机制 H.pylori感染可使AGS细胞中P-AKT表达增加,激活AKT信号通路,ADM表达随之升高,而加入信号通路抑制剂Wortmannin后,P-AKT表达降低,ADM表达随之降低。△cagA H.pylori感染AGS细胞时P-AKT的表达较WT H.pylori感染组低,且ADM的表达降低。说明幽门螺杆菌可依赖cagA通过PI3K/AKT信号通路调节ADM在胃上皮细胞中的表达。 4. 胃内ADM发挥的免疫调节作用及其分子机制 RT-PCR结果显示,在人胃组织中ADM 与 IFN-γ的表达呈正相关;免疫组织荧光双染结果显示ADM的特异性受体结构RAMP2与CD3+淋巴细胞在胃组织内有共表达;流式细胞技术结果显示,用 ADM 刺激 CD3+淋巴细胞后,其细胞增殖率及子代 IFN-γ+细胞比率呈现浓度依赖性增加;Western Blot检测结果显示,ADM可激活T淋巴细胞的PI3K/AKT和STAT3信号通路,分别抑制这两条信号通路后,再经ADM刺激,T淋巴细胞的细胞增殖率及子代IFN-γ+细胞比率下降。 研究结论和意义: 本文从体内和体外两个方面证明了H.pylori可以部分依赖于cagA诱导胃上皮细胞ADM表达升高,并且揭示了H.pylori可通过PI3K/AKT信号通路调控ADM表达的一种分子机制,同时发现ADM能够通过PI3K/AKT和STAT3信号通路诱导胃内T淋巴细胞的增殖和IFN-γ的表达,调节免疫功能,促进炎症反应。本研究为H.pylori的感染及相关胃病的防治提供了理论和实验支撑。