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蛋白质是构成生物体最重要的物质之一,人类摄取的蛋白质主要从食物中来。小麦作为世界第三大粮食作物,为人类提供了约25%的蛋白质摄入量,提高小麦蛋白质含量,改善小麦品质,是各国小麦育种家的主要目标。氨基酸是构成蛋白质的重要物质,参与生命体的多种代谢途径,充分利用氨基酸对植物的生长、发育有极其重要的作用。前人研究表明,位于细胞质膜上的氨基酸转运酶(AAPs)是识别、携带不同种类的氨基酸,参与生命代谢的重要介质。因此,充分发掘小麦中的氨基酸转运酶,阐述其功能,可为小麦的品质育种提供参考。 目前,关于植物AAPs的功能和机制的研究主要集中在模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)和水稻(Oryza sativa)中,小麦(Triticum aestivum L.)中尚缺乏系统研究。本文以小麦为研究材料,对其AAPs基因家族生物信息学分析、基因克隆、功能分析和连锁遗传效应研究,主要研究内容和结果如下: 1.小麦AAPs基因家族成员 (1)以水稻OsAAP1-OsAAP18的基因为参考序列,同源比对到小麦的21条染色体中的基因有47个,有13个基因在小麦的A、B、D同源群中都有拷贝,氨基酸相似性比对显示,拷贝之间具有较高的同源性(>80%)。 (2)AAPs均定位在细胞质膜上,用拟南芥、水稻、玉米、二穗短柄草和小麦进行聚类分析,分析小麦AAPs家族成员的亲缘关系,将其分为A和B两大类,并可进一步细分为4个亚类(A1、A2、B1、B2)。预测TaAA P1、TaAAP3、TaAAP6、TaAAP7、TaAAP8、TaAAP12、TaAAP15可能具有与已知功能APPs相似的功能。 2.小麦TaAAP6的克隆及标记的开发 (1)鉴定了115份西南麦区小麦品种的千粒重和蛋白含量,包括地方品种64份,育成品种51份,结果显示地方品种的蛋白含量极显著高于育成品种(P<0.01),千粒重则相反(P<0.01)。测定的表型结果同时也丰富了育种亲本资源的选择。 (2)在小麦中克隆了TaAAP6-3A、3B、3D三个同源等位基因,通过cDNA序列的克隆比对得到基因结构图,氨基酸序列比对显示TaAAP6-3B与TaAAP6-3D的亲缘关系更近(97.86%)。表达模式显示,在开花后7天的籽粒中,TaAAP6-3B的表达量高于TaAAP6-3A(约2倍)和TaAAP6-3D(约4倍),故而选取TaAAP6-3B进一步深入分析。 (3)115份西南麦区品种出现了两种等位变异TaAAP6-3B-Ⅰ(subⅠ)和TaAAP6-3B-Ⅱ(subⅡ),启动子区顺式作用元件分析、表达模式分析结合5个环境的表型鉴定(籽粒蛋白含量)关联分析显示,相比于subⅡ,subⅠ的蛋白含量更高。针对TaAAP6-3B-Ⅰ和TaAAP6-3B-Ⅱ差异位点开发了互补的分子标记BⅠ和BⅡ,在自然群体和F2遗传群体中进行验证,结果显示纯合类型Ⅰ的GPC极显著高于杂合型,而杂合型极显著高于纯合类型Ⅱ(P≤0.001)。 3.小麦TaAAP6-3B位点受到强烈的人工选择压力 (1)115份小麦品种两种基因型与千粒重的相关性同上述结果相反,两种性状的负相关系数为-0.317(P<0.01);再者,地方品种TaAAP6-3B位点的SNPs多态型明显比人工品种的丰富,说明TaAAP6-3B位点可能在长期的人工选择过程中受到了选择压力,代表高蛋白低千粒重的基因型TaAAP6-3B-Ⅰ被选择掉了。 (2)基于选择牵连效应理论,该基因位点可能存在一个调控千粒重的基因,预测TaAAP6-3B4Mb范围内的蛋白结构域,主要包含细胞壁合成相关酶、抵抗非生物胁迫酶以及起始转录因子。 本文的研究结果为利用氨基酸转运酶,改善小麦品质提供了一定的理论依据和候选基因资源。