论文部分内容阅读
我国早期流行的ALV-J主要致肉鸡髓样细胞瘤,其靶细胞主要为骨髓细胞。而后来流行的致蛋鸡血管瘤型ALV-J则对髓细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞等多种组织细胞有亲嗜致瘤特性,引起多种组织肿瘤,常发生混合型肿瘤。致蛋鸡血管瘤型ALV-J与早期致肉鸡髓样细胞瘤型ALV-J感染肉鸡时是否表现相同的致病特性及致瘤机制?在感染肉鸡鸡胚成纤维细胞(R-CEF)时,病毒增殖及细胞分子病理学反应上有无明显差异?有待于试验验证。本研究将分离于不同年代、不同品种、不同致瘤表型及基因结构存在一定差异的两株ALV-J(NX0101、HN10PY01)分别接种R-CEF建立细胞感染模型,比较研究病毒增殖及细胞肿瘤相关基因表达的异同。再将两株ALV-J分别人工接种AA父母代肉鸡鸡胚,建立动物感染模型,定期剖杀试验鸡,比较研究试验鸡的病毒感染状态、致病性及肿瘤相关基因表达情况。体外实验结果表明,两毒株分别感染R-CEF后,细胞培养上清中ALV群特异性抗原p27均呈阳性,且HN10PY01感染组显著高于NX0101感染组(P<0.05)。HN10PY01感染组细胞培养上清中病毒TCID50显著高于NX0101感染组(P<0.05)。荧光定量结果表明,两毒株感染R-CEF后,抑癌基因p53、p16 mRNA转录水平显著升高,原癌基因c-myc、c-myb的表达均显著升高,感染后期凋亡基因Bcl-2显著高表达。两毒株相比,感染后在第1、2、7d,NX0101感染组p53 mRNA转录水平显著高于HN10PY01感染组(P<0.05);感染前期,NX0101感染组p16 mRNA转录水平显著高于HN10PY01感染组(P<0.05),感染后期,HN10PY01感染组显著高于NX0101感染组(P<0.05);在整个试验过程中,两感染组c-myc、c-myb和Bcl-2基因mRNA转录水平差异不显著(P>0.05)。体内实验结果表明,两感染组泄殖腔拭子p27阳性率均为100%,NX0101感染组p27数值显著高于HN10PY01感染组(P<0.05);两感染组病毒血症均为阳性,5W后,NX0101感染组病毒血症数值显著高于HN10PY01感染组(P<0.05)。两感染组血清ALV-J抗体阴性,感染鸡免疫耐受。NX0101感染组死亡率30%,致瘤率45%,诱发髓样细胞瘤4例,淋巴细胞瘤1例,髓样细胞瘤与纤维肉瘤混合型肿瘤3例,髓样细胞瘤、血管瘤和纤维肉瘤混合型肿瘤1例;HN10PY01感染组死亡率20%,致瘤率35%,诱发血管瘤3例,髓样细胞瘤1例、髓样细胞瘤和纤维肉瘤混合瘤、淋巴肉瘤和纤维肉瘤混合型肿瘤各1例。两感染组ND和AIV-H9抗体水平显著低于对照组(P<0.05),两感染组间差异不显著(P>0.05);感染鸡平均体重、胸腺、法氏囊发育指数显著低于对照组(P<0.05),两感染组相比,感染后期NX0101感染组显著低于HN10PY01感染组(P<0.05)。荧光定量结果表明,与对照组相比,两感染组鸡只各器官组织中p53基因mRNA转录水平显著升高(P<0.05),两感染组相比,感染后期NX0101感染组骨髓、肝脏、肺脏组织中p53 mRNA转录水平显著高于HN10PY01感染组(P<0.05),经测序证实高表达的p53基因主要为突变型,多为点突变,感染后期血清p53蛋白及抗体水平显著高于对照组(P<0.05),两感染组差异不显著(P>0.05);两感染组鸡只心脏p16基因低表达(P<0.05),感染前期肝脏低表达后期失表达,其他各器官组织失表达;原癌基因c-myc显著高表达(P<0.05),感染后期NX0101感染组肝脏c-myc mRNA转录水平显著高于HN10PY01感染组,在其他各器官组织中差异不显著(P>0.05);原癌基因c-myb未见明显变化(P>0.05);凋亡基因Bcl-2 mRNA转录水平显著升高(P<0.05),两感染组差异不显著(P>0.05);两感染组VEGF及其受体基因mRNA转录水平显著高表达(P<0.05),两感染组差异不显著(P>0.05);两感染组HSP70基因显著高表达(P<0.05),两感染组差异不显著(P>0.05)。血清中HSP60、HSP70抗体水平显著高于对照组(P<0.05),两感染组相比,感染后期NX0101感染组显著高于HN10PY01感染组(P<0.05);感染前期,两感染组血清HSP90抗体水平显著高于对照组(P<0.05),两感染组差异不显著(P>0.05)。体外试验比较研究表明,两毒株感染R-CEF后病毒的复制能力及毒力有明显差异,肿瘤相关基因表达上有所不同,但基本表达一致;体内试验结果表明两毒株的感染状态、致病性、致瘤表型及致瘤机制上也存在一定的差异。综合评价HN10PY01毒株在R-CEF上的感染复制能力强于NX0101毒株,而AA父母代肉鸡对NX0101毒株更为易感,NX0101感染组死亡率及致瘤率更高,以髓样细胞瘤为主,而HN10PY01感染组以血管瘤为主。两毒株体内外感染复制能力不同,致瘤表型存在明显差异,但肿瘤相关基因异常表达上基本一致。本研究为探讨宿主遗传背景对ALV-J感染致瘤作用的影响、ALV-J宿主范围扩大以及致瘤表型演变的分子病理学机制提供一定的理论价值。