瘤胃上皮存在着一个复杂的免疫调控网络。这一网络能响应正常生理状态下瘤胃微生物群落结构的改变而做出相应的调控反应,维持瘤胃上皮对共生微生物的免疫耐受性。但是目前,瘤胃上皮的免疫调控网络感受饲喂引起的瘤胃微生物群落结构改变而做出反应,维持上皮免疫耐受的调控机制尚无报道。Toll样受体(TLR)基因家族是迄今为止在单胃动物中研究的最为深入的一种微生物模式识别受体(PRRs)。它们通过与特定的微生物配体相结合来引起或抑制消化道上皮的炎症反应,进而维持消化道的免疫平衡。目前发现,该基因家族的6个成员在反当动物瘤胃上皮的胃腔面持续表达,然而其功能尚无报道。在此基础上,本研究首先利用16SrRNA基因测序技术对15%及31%NFC日粮饲喂下的瘤胃微生物的群落结构进行比较分析;然后,运用荧光定量PCR对瘤胃上皮TLR基因家族的6个成员及TLR下游通路中5种关键基因的表达量进行比较分析;最后,运用统计学的方法对微生物的丰富度和Toll样受体基因的表达量进行了相关分析。通过上述实验及分析流程,本研究旨在阐明瘤胃上皮胃腔面表达的Toll样受体基因对其免疫耐受性的维持机制。1.NFC对山羊瘤胃微生物群落结构的影响6只山羊(波尔山羊,白色,4月龄)随机分成两组,分别饲喂包含15%NFC(LNFC组,n=3)和31%NFC(MNFC组,n=3)的日粮四周后,采集所有山羊的瘤胃液样本,提取瘤胃液微生物群落的总DNA,应用16S rDNA的V3V4区通用引物对每个宏基因组进行PCR扩增,从而获取每个瘤胃液样本中所有细菌的V3V4片段。通过Illumina Miseq测序及生物信息学分析,我们发现,LNFC组的微生物群落包含16个门,72个属的细菌序列,其中Bacteroidetes、Firmicutes、Proteobacteria和Verrucomicrobia门的序列丰富度最高,分别占总量的81.5%、12.6%、1.2%和1.1%;MNFC组样本包含21个门,107 个属的细菌序列,其中 Bacteroidetes、Firmicutes、Verrucomicrobia、Synergistetes、Proteobacteria和Lentisphaerae门的序列丰富度最高,分别占总量的72%、14.4%、4.4%、3.5%、1.2%和1.2%。比较两组样本的多样性后发现,MNFC日粮饲喂下瘤胃微生物群落多样性比LNFC日粮饲喂下的微生物群落多样性出现显著升高。在相对丰富度方面,Verrucomicrobia细菌的相对丰富度增加最为明显,而一些机会致病茵Rikenella、Anaeroplasma、Olsenella的相对丰富度则出现显著降低。2.瘤胃上皮胃腔面TLRs对饲喂引起的微生物结构改变的响应模式饲喂实验结束后,将所有的山羊进行屠宰,采集其瘤胃上皮样本,并从中提取样本的总RNA,通过荧光定量PCR对TLR基因家族的6个成员(TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6、TLR10),及TLR信号通路中的髓样分化因子88(MyD88)、前炎症细胞因子白介素(IL)-1β、IL-6、干扰素(IFN)-γ和抗炎症细胞因子IL-10的基因表达量进行定量分析,结果表明,相较于LNFC组的上皮样本,MNFC组的TLR1、TLR6、TLR10表达量显著上升,而IL-1β、IL-6和IL-10的表达量则显著下调。随后,我们利用典型关联分析(CCA),将两组样本中相对丰富度出现显著差异的菌株和上皮差异表达的TLRs(TLR1、TLR6、TLR10)相关联,结果表明,Verrucomicrobia subdivision 5属共生菌相对丰富度的增加与TLR10表达量的上升呈高度正相关。由此,我们推断,NFC引起的瘤胃微生物群落中特定共生菌数量的增加促进了瘤胃上皮TLR10信号的增强,而TLR10信号的增强又进一步促进了瘤胃上皮对其微生物群落的免疫耐受性。3.NFC组引起的瘤胃微生物结构改变对瘤胃代谢及上皮转运功能的影响。为了进一步了解不同NFC日粮饲喂引起的瘤胃微生物群落中共生菌的变化情况,我们测量了瘤胃液中微生物的主要代谢产物短链脂肪酸(SCFAs)浓度及瘤胃上皮中与SCFAs吸收相关的10种基因的表达情况。结果表明,MNFC组山羊瘤胃中的SCFAs浓度显著高于LNFC组,同时上皮中与SCFAs吸收相关的基因表达量均出现显著上调。这一结果表明,MNFC组中新增的菌株促进瘤胃的发酵和上皮对能量物质的转运,由此表明MNFC组中新增的菌株极有可能为促进瘤胃发酵与营养物质吸收的瘤胃共生菌,而非机会病原菌。综上所述,NFC引起的瘤胃微生物群落扩增可通过增加TLR10信号强度来抑制上皮的炎症反应,进而促进瘤胃上皮对其共生微生物的免疫耐受性,与此同时,NFC引起的上皮免疫耐受增强有利于瘤胃对能量与营养物质的转运。