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第一部分特发性肺动脉高压患者肺动脉平滑肌细胞上的钙敏感受体功能激活伴表达增加目的：观察特发性肺动脉高压（Idiopathic Pulmonary Arterial Hypertension, IPAH）患者肺动脉平滑肌中钙敏感受体(Ca2+-sensing receptor，CaSR)的表达变化，并探索原代分离IPAH患者的肺动脉平滑肌细胞（Pulmonary artery smooth musclecells,PASMCs）上CaSR的功能改变，评价CaSR在特发性肺动脉高压发病机制中的特点和意义。方法：采用Western Blot法检测IPAH患者和正常对照者肺组织及原代分离出的PASMCs上CaSR蛋白的表达，并用免疫荧光染色方法检测IPAH患者和正常对照者肺动脉组织中CaSR的表达。进而，用PASMC胞浆内钙离子浓度测定等方法，以梯度提高细胞外钙离子激活CaSR后胞浆内钙离子浓度([Ca2+]cyt)变化的程度为评价CaSR功能的指标，比较从IPAH患者和正常对照者肺动脉分离出并原代培养的PASMC上CaSR的功能。结果：分别提取特发性肺动脉高压患者和无肺动脉高压者肺组织蛋白，行WesternBlot检测， CaSR表达在IPAH组（n=6）较对照组（n=6）均明显升高。定量分析：IPAH患者肺组织（n=6）中CaSR蛋白的表达（1.45+0.20倍于β-tubulin）较正常对照组（n=6）（0.12+0.02倍于β-tubulin）升高（P＜0.01）。进而，对各组肺组织行免疫荧光染色，与对照组（n=6）比较，IPAH患者（n=6）肺动脉中CaSR蛋白的表达明显升高；用ImageJ软件对荧光染色图像进行分析，IPAH组的灰度值为90+11，明显高于对照组48+8，差异有统计学意义（P值均＜0.01）。Western Blot分别检测特发性肺动脉高压患者和无肺动脉高压者原代分离的PASMC中CaSR表达，IPAH组较对照组均明显升高；定量分析，IPAH患者PASMC中CaSR蛋白的表达（0.67+0.15倍于β-tubulin）较正常对照PASMC组（0.15+0.02倍于β-tubulin）升高（n=6）（P＜0.01）。先后用无钙液体和2.2mmol/L的有钙液体灌流PASMC观察[Ca2+]cyt的变化，无肺动脉高压组PASMC（n=56）前后变化不明显，差异无统计学意义（P值均>0.05）；而特发性肺动脉高压患者组PASMC（n=55）用2.2mmol/L的有钙液体灌流后胞内钙浓度峰值明显升高（605+163nM），差异有统计学意义（P值＜0.05），提示在特发性肺动脉高压患者组PASMC中CaSR功能被激活。结论：CaSR在特发性肺动脉高压患者肺动脉组织中的表达较正常对照组明显升高，并且其功能在特发性肺动脉高压患者分离的PASMC中明显被激活。提示特发性肺动脉高压中，PASMC上的CaSR被上调和激活，其意义可能与特发性肺动脉高压发生发展的机制有关。第二部分激活钙敏感受体通过PLC-IP3途径引起特发性肺动脉高压患者肺动脉平滑肌细胞胞浆内钙离子浓度升高目的：探讨激活和上调CaSR导致特发性肺动脉高压（IPAH）患者肺动脉平滑肌细胞（PASMC）胞浆内钙离子浓度升高的初步机制，探索PASMC中CaSR是否通过经典的PLC-IP3途径调节细胞内钙信号，引起胞浆内钙离子浓度升高，进而导致肺动脉高压。方法：以特发性肺动脉高压（IPAH）患者原代分离出PASMC为研究对象，体外用磷脂酶C（PLC）抑制剂U73122或三磷酸肌醇受体（IP3R）抑制剂xestospongin C预处理细胞，观察梯度提高细胞外钙离子浓度激活CaSR后引起的[Ca2+]cyt变化,以同样方法，用U73343（U73122的无活性同类体）、地尔硫卓[电压依赖的钙通道（VDCC）的阻滞剂)]和KB-R7943(Na+/Ca2+交换的抑制剂)为对照，观察有无其他途径参与激活CaSR引起的[Ca2+]cyt升高。结果：先后用无钙液体和2.2mmol/L的有钙液体灌流PASMC观察[Ca2+]cyt的变化，IPAH组PASMC（n=57）中[Ca2+]cyt在2.2mmol/L的有钙液体灌流后明显升高,峰值达495+59nM，1μM PLC抑制剂U73122加入2.2mmol/L的有钙液体灌流PASMC后[Ca2+]cyt的上升幅度明显受到抑制，峰值降低到190+21nM，差异有统计学意义（P＜0.01）。而用U73343（U73122的无活性同类体）1μM加入2.2mmol/L的有钙液体灌流PASMC（n=45）后[Ca2+]cyt的上升幅度未受到抑制，峰值由880+70nM变化到830+75nM，差异无统计学意义（P>0.05）。进而以同样方法，IPAH-PASMC（n=46）中[Ca2+]cyt在2.2mmol/L的有钙液体灌流后明显升高,峰值达918+89nM，地尔硫卓10μM加入2.2mmol/L的有钙液体灌流PASMC后[Ca2+]cyt的上升幅度无变化，峰值为923+82nM，差异无统计学意义（P>0.05）。最后,用相同方法发现，IPAH-PASMC （n=22）中[Ca2+]cyt在2.2mmol/L的有钙液体灌流后明显升高,峰值达1350+316nM，而KB-R7943(Na+/Ca2+交换的抑制剂)10μM加入2.2mmol/L的有钙液体灌流PASMC后[Ca2+]cyt的上升幅度无变化，峰值为1253+213nM，差异无统计学意义（P>0.05）。结论：特发性肺动脉高压患者PASMC上钙敏感受体被激活，进而通过经典的PLC-IP3途径调节细胞内钙信号，引起肺动脉高压。第三部分钙敏感受体在肺动脉高压大鼠和小鼠的肺动脉平滑肌细胞中功能激活伴表达增加目的：探讨CaSR在野百合碱（MCT）致肺动脉高压（MCT-PH）大鼠模型和慢性缺氧致肺动脉高压（HPH）小鼠PASMC中的表达，并观察从肺动脉高压动物原代分离的PASMC中CaSR的功能变化。方法：采用Western Blot、PCR和免疫荧光染色等方法检测，比较①MCT-PH大鼠和正常大鼠②HPH小鼠和正常小鼠中肺动脉组织或分离出PASMC中CaSR的表达，并且用PASMC胞浆内钙离子浓度测定的方法，比较从①MCT-PH大鼠和正常大鼠②HPH小鼠和正常小鼠中肺动脉分离出的原代培养的PASMC中CaSR的功能，通过梯度提高细胞外高浓度钙离子激活CaSR，检测胞浆内钙离子浓度([Ca2+]cyt)变化的程度来评价CaSR功能的变化。结果：用大鼠分离的肺动脉行PCR检测，结果发现MCT大鼠组（n=6）（4.51+0.21倍于GAPDH）明显高于对照组（n=6）（0.95+0.11倍于GAPDH）（P值＜0.05）。用大鼠分离的肺组织行Western Blot检测，结果发现MCT大鼠组（n=6）（1.12+0.11倍于β-tubilin）明显高于对照组（n=6）（0.49+0.15倍于β-tubilin）（P值＜0.05）；用免疫荧光染色方法检测大鼠肺动脉CaSR表达，发现MCT大鼠组（n=6）明显高于对照组（n=6）。用小鼠分离的肺组织行Western Blot检测，结果发现HPH小鼠组（n=6）（1.19+0.09倍于β-tubilin）明显高于对照组（n=6）（0.31+0.04倍于β-tubilin）（P值＜0.05）。用小鼠分离的肺动脉行Realtime PCR检测，结果发现ΔΔCt在HPH小鼠组（n=6）（1.21+0.10）明显高于对照组（n=6）（0.31+0.04）（P值＜0.05）。在大鼠PASMC实验中，先后用无钙液体和2.2mmol/L的有钙液体灌流PASMC观察[Ca2+]cyt的变化，正常组PASMC（n=45）灌流后[Ca2+]cyt上升的峰值为51+16nM，而MCT大鼠组PASMC（n=46）中[Ca2+]cyt在2.2mmol/L的有钙液体灌流后明显升高，峰值为550+71nM，用CaSR抑制剂NPS2143干预细胞后，MCT组的[Ca2+]cyt在2.2mmol/L的有钙液体灌流后的升高幅度明显被抑制，峰值下降到91+22nM，较抑制前比较，差异有统计学意义，P值均＜0.05；而正常组无明显变化，峰值为59+21nM，较抑制前比较，差异有统计学意义，P值>0.05)。进而，在小鼠PASMC实验中，先后用无钙液体和2.2mmol/L的有钙液体灌流PASMC观察[Ca2+]cyt的变化，正常组PASMC（n=44）灌流后[Ca2+]cyt上升的峰值为182+19nM，而HPH小鼠组PASMC（n=46）中[Ca2+]cyt在2.2mmol/L的有钙液体灌流后明显升高，峰值为570+19nM，用CaSR抑制剂NPS2143干预细胞后，HPH小鼠组的[Ca2+]cyt在2.2mmol/L的有钙液体灌流后的升高幅度明显被抑制，峰值下降到206+21nM，较抑制前比较，差异有统计学意义，P值＜0.05；而正常组无明显变化，峰值为179+11nM，较抑制前比较，差异有统计学意义，P值>0.05。结论：CaSR在MCT-PH大鼠和HPH小鼠肺动脉组织中的表达较正常对照组升高。较正常对照组，CaSR功能在MCT-PH大鼠和HPH小鼠组PASMC中明显被激活。从而进一步提示CaSR的上调和激活在肺动脉高压发病机制中有重要意义。第四部分动物模型中抑制钙敏感受体的功能预防和逆转肺动脉高压的发生发展目的：用CaSR抑制剂NPS2143抑制野百合碱（MCT）致肺动脉高压（MCT-PH）大鼠模型和慢性缺氧致肺动脉高压（HPH）小鼠PASMC中CaSR的功能后，观察肺动脉高压发生发展的变化。方法：建立肺动脉高压的两种经典的动物模型：MCT-PH大鼠模型和HPH小鼠。腹腔注射CaSR抑制剂（变构剂）NPS2143到动物体内，采用预先给药和模型建立后给药两种方式，正常对照组以腹腔注射DMSO为对照，观察大鼠和小鼠右心室收缩末期压（RVSP）、右心肥厚指数、远端肺动脉厚度、右心室纤维化程度、远端肺动脉数量和分布等的变化。结果：注射MCT到大鼠后，d1-10注射CaSR抑制剂（变构剂）NPS2143到动物模型中，d14收获大鼠，发现：与肺动脉高压模型组（n=6）相比，NPS2143组干预组（n=6）中右心室收缩末期压（RVSP）（30.5+3.6mmHg versus37.5+6.6mmHg）和右心肥厚指数均明显下降（0.27+0.05versus0.40+0.03），差异均有统计学意义（P值均＜0.05）；NPS2143组干预组中远端肺动脉的厚度明显降低，直径<50μm的肺动脉平均厚度为（6.1+5.1μm）较MCT大鼠组（15.1+4.8μm）下降，差异均有统计学意义（P值＜0.05）；直径>50μm但<100μm的肺动脉平均厚度为（11.1+4.1μm）较MCT大鼠组（20.3+3.5μm）下降，差异均有统计学意义（P值＜0.05）；直径>100μm的肺动脉平均厚度为（14.1+3.3μm）较MCT大鼠组（26.4+10.1μm）下降，差异均有统计学意义（P值＜0.05）；HPH小鼠预先注射CaSR抑制剂（变构剂）NPS2143到动物模型中（d1-22）, d28收获小鼠，发现：与肺动脉高压模型组（n=6）相比，NPS2143组干预组（n=6）中右心室收缩末期压（RVSP）（30.5+1.1mmHg versus38.5+1.6mmHg）、右心肥厚指数明显下降（0.29+0.01versus0.39+0.01），差异均有统计学意义（P值均＜0.05）；与肺动脉高压模型组相比，HE染色显示，NPS2143组干预组中远端肺动脉厚度明显下降。肺动脉造影显示，NPS2143组干预组中相同部位的单位面积内远端肺动脉分支数、节点数和总长度较肺动脉高压组明显增加(单位面积的分支数：75.1+2.1/mm2vesus32.2+1.5/mm2;单位面积的节点数：35.2+1.7/mm2vesus11.2+0.5/mm2;单位面积的总长度：5.1+1.5mm/mm2vesus1.9+0.2mm/mm2),差异均有统计学意义，P值均＜0.01。注射MCT到大鼠后，d14-28注射CaSR抑制剂（变构剂）NPS2143到动物模型中，d28收获大鼠，发现：与肺动脉高压模型组（n=6）相比，NPS2143组（n=6）干预组中右心室收缩末期压（RVSP）（41.5+6.1mmHg versus31.5+2.6mmHg）下降，且RVSP下降幅度明显（21.5+5.1mmHg versus5..5+2.6mmHg），差异均有统计学意义（P值均＜0.05）；与肺动脉高压模型组相比，NPS2143组干预组干预组中右心室肥厚指数（0.39+0.02versus0.29+0.04）和纤维化程度明显下降)（17.1%+2.2%versus8.1%+1.2%）（P值均＜0.05）。HPH小鼠模型中，d14-28注射CaSR抑制剂（变构剂）NPS2143到动物模型中，d28收获小鼠，发现：与肺动脉高压模型组（n=6）相比，NPS2143组（n=6）干预组中右心室收缩末期压（RVSP）(31.1+1.6mmHg v2+rsus42.5+2.1mmHg)下降，差异均有统计学意义（P值均＜0.05）；与肺动脉高压模型组相比，NPS2143组干预组干预组中右心室肥厚指数(0.30+0.01v2+rsus0.41+0.02)和纤维化程度明显下降)(7.1%+0.6%v2+rsus14.2%+0.8%)（P值均＜0.05）。结论：在野百合碱致肺动脉高压大鼠和慢性缺氧致肺动脉高压小鼠肺动脉高压模型中，预防性和治疗性实验中均证实NPS2143抑制钙敏感受体功能可以预防和逆转肺动脉高压的发生发展。