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目的:酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)是因长期过量饮酒引起的中毒性肝脏疾病,其中包括轻症ALD、酒精性脂肪肝(alcohol fatty liver disease,AFLD)、酒精性肝炎、酒精性肝纤维化和酒精性肝硬化等类型。严重酗酒时可诱发广泛肝细胞坏死,甚至肝功能衰竭。ALD病因明确,但其发病机制目前尚不完全清楚,可能与酒精及其代谢产物对肝脏的毒性作用、氧化应激、脂质过氧化、免疫反应与内毒素、细胞因子等密切相关。我们应用酒精灌胃建立的大鼠ALD模型发现,肝组织SIRT1 m RNA和蛋白表达逐渐减少的同时SFRS10 m RNA和蛋白的表达逐渐减弱,总Lipin 1及细胞质中Lipin1-β的表达逐渐增多而细胞核中的Lipin1-α表达逐渐减少。Pihlajam?ki等研究发现在肥胖患者和高脂饮食小鼠肝组织中SFRS10表达减弱,且SFRS10的表达量与选择性剪接表达Lipin 1的功能亚型有关。Yin等报道酒精以浓度依赖的方式抑制小鼠肝细胞株SIRT1表达的同时SFRS10表达减弱。因此,抑制SIRT1的表达对SFRS10以及Lipin 1表达的影响值得进一步研究。本研究选用能代谢酒精的小鼠AML-12细胞,给予梯度酒精培养及si RNA干扰敲除SIRT1基因,应用RT-q PCR和Western blot法检测SFRS10,Lipin 1,Lipin1-β和Lipin1-α的m RNA和蛋白表达;应用油红O染色观察细胞内脂质沉积;应用免疫荧光染色观察Lipin 1的细胞定位。在细胞水平阐明抑制SIRT1的表达对SFRS10、Lipin 1表达的影响。方法:复苏AML-12细胞用含10%胎牛血清、1%丙酮酸钠、1‰的HEPES、1%青链霉素的高糖DMEM培养基在5%CO2,37℃条件下培养至对数生长期,梯度酒精培育AML-12细胞,根据不同酒精浓度,分为0m M组(正常对照组)、40m M组、80m M组、120m M组;敲除SIRT1基因,分为空白对照组(Blank)、SIRT1si RNA阴性对照组(SIRT1si RNA NC)、SIRT1si RNA组、SIRT1si RNA+Ethanol组。1首先实验组分别用40m M、80m M、120m M浓度的酒精培育AML-12细胞,对照组常规培养并加入等体积无菌生理盐水,培养24h后,吸取旧培养液,收集细胞,分别应用实时荧光定量聚合酶连反应(Real Time-quantitative Polymerase Chain Reaction,RT-q PCR)和Western blot法检测SIRT1、剪切因子SFRS10和Lipin 1(核、浆)的m RNA和蛋白表达水平;用4%多聚甲醛固定,行油红O染色观察细胞内脂质沉积;行免疫荧光染色,观察Lipin 1的胞浆或胞核分布。2实验组分别将SIRT1si RNA阴性对照序列、SIRT1si RNA转染至AML-12细胞,以仅加相同体积的脂质体作为空白对照组,培养6h后,更换为新鲜完全培养液继续培养至24小时,SIRT1si RNA+Ethanol组给予120m M浓度的酒精,余组加等体积的生理盐水,继续培养24h,收集细胞,分别应用RT-q PCR和Western blot法检测SIRT1、剪切因子SFRS10和Lipin 1(核、浆)的m RNA和蛋白表达水平;用4%多聚甲醛固定,行油红O染色观察细胞内脂质沉积;行免疫荧光染色,观察Lipin 1的胞浆或胞核分布。结果:1梯度酒精(0m M、40m M、80m M、120m M)刺激AML-12细胞,各个指标m RNA和蛋白表达变化及细胞病理学改变1.1 RT-q PCR法检测SIRT1、SFRS10、总Lipin 1、Lipin1-β及Lipin1-αm RNA的表达变化:如Fig.1及Table 2所示,正常AML-12细胞中表达SIRT1,SFRS10较多,总的Lipin 1,细胞质Lipin1-β及细胞核Lipin1-α表达均较少,随着酒精浓度的增加,SIRT1表达逐渐减少,SFRS10的表达逐渐减弱;总的Lipin 1和细胞质中Lipin1-β表达量均逐渐增多,而细胞核中Lipin1-α表达逐渐减少(F值分别为35.64,16.59,100.81,78.92,28.41,P均<0.01)。如Fig.2及Table 3所示,随着酒精浓度增加,Lipin1-β/α比值逐渐升高(F值为119.98,P均<0.01)。1.2 Western blot法检测SIRT1、SFRS10、总Lipin 1、Lipin1-β及Lipin1-α的蛋白水平表达变化:如Fig.4及Table 4所示,正常AML-12细胞中表达SIRT1,SFRS10较多,总的Lipin 1,细胞质Lipin1-β及细胞核Lipin1-α表达均较少,随着酒精浓度的增加,SIRT1表达逐渐减少,SFRS10的表达逐渐减弱;总的Lipin 1和细胞质中Lipin1-β表达量均逐渐增多,而细胞核中Lipin1-α表达逐渐减少(F值分别为64.79,74.46,97.11,71.74,57.62,P均<0.01)。1.3油红O染色法观察小鼠AML-12细胞内的脂变:如Fig.5所示,正常对照组(0m M组)AML-12细胞内未见脂肪变性,40m M浓度酒精刺激时,AML-12细胞内可见少量橘红色脂滴,120m M浓度酒精刺激时,AML-12细胞内可见较多的橘红色脂滴。1.4免疫荧光染色法观察小鼠AML-12细胞中Lipin 1蛋白的细胞定位:如Fig.6所示,正常对照组示Lipin 1蛋白主要位于细胞质,细胞核也表达少量的Lipin 1蛋白。随着酒精浓度的增加,细胞质中Lipin 1蛋白表达逐渐增多,细胞核中的Lipin 1蛋白表达逐渐减少。2敲除小鼠AML-12细胞中SIRT1基因,各个指标m RNA和蛋白表达变化及细胞病理学改变2.1敲除SIRT1基因通过RT-q PCR法检测SIRT1、SFRS10、总Lipin 1、Lipin1-β及Lipin1-αm RNA的表达:如Fig.7及Table 5所示,正常AML-12细胞中表达SIRT1、SFRS10较多,总的Lipin 1、细胞质Lipin1-β及细胞核Lipin1-α表达均较少,敲除SIRT1基因,SIRT1si RNA组与空白对照组比较,SIRT1的表达降低约42%的同时SFRS10的表达明显减少,总的Lipin 1和细胞质中Lipin1-β表达量明显增多,而细胞核中Lipin1-α表达明显减少(P均<0.01);在敲除SIRT1基因并加入酒精刺激后,SIRT1、SFRS10、Lipin1-α表达进一步减少,总Lipin 1、细胞质Lipin1-β的表达进一步增加,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01);SIRT1si RNA阴性对照组和空白对照组比较,各个指标表达的变化,差异均无统计学意义(P均>0.05)。如Fig.8及Table 6所示,Lipin1-β/α的比值,敲除基因SIRT1,SIRT1si RNA组与空白对照组比较,Lipin1-β/α的比值明显增高,差异有统计学意义(P<0.01)。在敲除SIRT1基因并加入酒精刺激后,Lipin1-β/α的比值进一步升高,SIRT1si RNA+Ethanol组与SIRT1si RNA组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。2.2敲除SIRT1基因通过Western blot法检测SIRT1、SFRS10、总Lipin 1、Lipin1-β及Lipin1-α的蛋白水平表达变化:如Fig.10及Table 7所示,正常AML-12细胞中表达SIRT1、SFRS10较多,总Lipin 1、细胞质Lipin1-β及细胞核Lipin1-α表达均较少,敲除SIRT1基因,SIRT1si RNA组与空白对照组比较,SIRT1的表达降低45%的同时SFRS10的表达明显减少,总的Lipin 1和细胞质中Lipin1-β表达明显增多,而细胞核中Lipin1-α表达明显减少(P均<0.01);在敲除SIRT1基因并加入酒精刺激后,SIRT1、SFRS10、Lipin1-α表达进一步减少,总Lipin 1、细胞质Lipin1-β的表达进一步增加,SIRT1si RNA+Ethanol组与SIRT1si RNA组比较,差异均有统计学意义(P均<0.01)。而各个指标中SIRT1si RNA阴性对照组和空白对照组比较,差异均无统计学意义(P均>0.05)。2.3油红O染色法观察小鼠AML-12细胞内的脂变:如Fig.11所示,油红O染色示正常对照组及阴性对照组中AML-12细胞内未见脂肪变性,敲除SIRT1基因,AML-12细胞内可见较多的橘红色脂滴,敲除SIRT1基因并加入120m M浓度酒精刺激,AML-12细胞内可见大量的橘红色脂滴。2.4免疫荧光染色法观察小鼠AML-12细胞中Lipin 1蛋白的细胞定位:如Fig.12所示,正常对照组及阴性对照组示Lipin 1蛋白主要位于细胞质,细胞核也表达少量Lipin 1蛋白。敲除SIRT1基因,细胞质中的Lipin 1蛋白表达明显增多,细胞核中的Lipin 1蛋白表达明显减少。敲除SIRT1基因并加入120m M浓度酒精刺激,细胞质中的Lipin 1蛋白表达进一步增多,细胞核中的Lipin 1蛋白表达进一步减少。结论:SIRT1上游调节着SFRS10、Lipin 1的表达,这可能为酒精性脂肪性肝病发生的重要机制之一。