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乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染是全球范围内的重要公共卫生问题。HBV为嗜肝病毒，只能在肝细胞中增殖，目前HBV复制与抑制相关的研究大多采用HBV质粒瞬时转染Huh7或HepG2细胞的方法，但在进行药物筛查、病毒制备等需要稳定均一的实验条件时，稳定整合细胞株是更好的选择。HepG2.2.15和HepAD38是当前用于HBV研究的最常用的两株细胞株，其构建策略为随机整合方式，且这两株细胞株均为Genotype D型。有研究表明，不同基因型乙型肝炎病毒有不同的地理分布特征，在复制、感染、耐药、突变等方面有所差异，对于疾病的进展、治疗应答和预后转归有不同的提示意义，因此在综合全面研究HBV时，需要对不同基因型的HBV进行评价。 Sleeping Beauty转座子是一种高效稳定的基因转移工具，它能通过“剪切-粘贴”的方式将外源目的基因整合入宿主细胞基因组中，国内外尚无利用Sleeping Beauty转座子构建HBV稳定整合细胞株的报道。本研究设计搭建了一种新型的携带Sleeping Beauty转座子（包括ITRs正反向重复序列和SB100X转座酶元件）、荧光报告基因(mCherry)、真核抗性基因（Puro嘌呤霉素）的ALL-IN-ONE载体并命名为pTsmP。从临床血清样本中提取了不同基因型的HBV序列连入pTsmP载体中，构建筛选了不同基因型的稳定整合乙型肝炎病毒细胞株，最终选取了最为常见的GenotypeA、B、C、D四型细胞株进行后续研究，Southern/Northern Blot、CLEIA检测与间接免疫荧光检测结果表明经过数十代传代培养，不同基因型的细胞株均稳定复制转录且在一定范围内稳定表达HBsAg、HBeAg和HBcAg等病毒蛋白。恩替卡韦(Entecavir，ETV)体外药物阻断试验结果显示，所制备的四型HBV均对ETV有较好的敏感性。 综上所述，本研究成功设计了基于Sleeping Beauty转座子系统快速构建不同基因型HBV稳定整合细胞株的方法，并验证了其可行性。此研究为HBV细胞株的构建和乙型肝炎病毒的制备方法提供思路，为HBV复制、感染等相关研究提供更加全面稳定的实验工具。