第一部分雷公藤甲素对CIA大鼠软骨破坏的影响及机制研究目的采用胶原诱导关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)大鼠模型,观察雷公藤甲素(Triptolide,TP)治疗后大鼠关节、滑膜组织形态变化,评价软骨及骨质破坏情况,检测基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase,MMPs)的表达,并检测组蛋白H3K27、催化H3K27组蛋白甲基化转移酶EZH2、去甲基转移酶JMJD3的表达,探讨TP对CIA大鼠软骨破坏的作用及可能机制。方法(1)选取适应性喂养一周的SPF级Wistar雄性大鼠60只,随机选取8只作为对照组,其余采用牛Ⅱ型胶原+完全弗氏佐剂尾背部多点注射建立类风湿关节炎模型。(2)造模成功的大鼠分别随机挑选并分为模型组(CIA)8只、雷公藤甲素低剂量组(TPL)8只、雷公藤甲素高剂量组(TP H)8只。(3)在造模第21天开始给予雷公藤甲素低剂量组(3.15mg/kg·d)灌胃,雷公藤甲素高剂量组(5.36mg/kg·d)灌胃,模型组(CIA)、对照(control给予等体积生理盐水灌胃,连续灌胃28天。(4)饲养期间观察大鼠的毛色、食欲精神状态等一般情况,每周测量关节爪径,并记录体重。(5)灌胃28天后,外周血测ELISA、大鼠脾脏称重留存、后爪、大鼠股骨固定后做Micro-CT,左侧滑膜组织多甲固定做HE和组化,右侧滑膜组织新鲜冻存做RT-PCR,踝关节脱钙处理并包埋用于甲苯胺蓝染色和番红固绿染色。(6)ELISA法检测外周血上清中白介素-6(IL-6)、白介素-1β(IL-1β)的浓度,Micro-CT观察大鼠关节后爪、股骨骨量及骨小梁结构情况,HE法观察滑膜组织和踝关节病理变化,番红固绿和甲苯胺蓝法观察软骨情况,组化法检测基质金属蛋白酶(MMP-3)、明胶酶(MMP-9)、胶原酶-3(MMP-13)的表达,RT-PCR法检测H3K27及对应组蛋白甲基化酶(EZH2)、组蛋白去甲基化酶(JMJD3)的表达。结果1.与对照组相比,模型组脾指数升高(p>0.05),而雷公藤甲素高剂量组灌胃治疗后脾指数明显下降(p<0.05),具有统计学差异。与对照组相比,模型组关节炎指数升高;与模型组相比,雷公藤甲素灌胃治疗后关节炎指数下降。2.Micro-CT法显示:与对照组相比,模型组踝关节关节面模糊,关节腔周围出现皮质骨的侵蚀,近端指间关节也有破坏,部分骨皮质出现虫蚀样改变。与模型组相比,雷公藤甲素灌胃治疗后指间关节明显改善,掌指关节也稍有改善。Micro-CT扫描胫骨、三维重构后,观察生长版区域发现骨小梁变薄,数量减少,骨小梁空间增大,结构紊乱、受损、穿孔或变形为杆状,结构消失。经雷公藤甲素灌胃治疗后,骨皮质缺损明显减轻,骨小梁结构有所改善。对胫骨扫描重构分析发现,与对照组相比,模型组骨体积分数(BV/TV)、骨表面积与组织体积比(BS/TV)下降(p<0.05),差异具有统计学意义。与模型组相比,雷公藤甲素组BV/TV、BS/TV上升(p<0.05),差异具有统计学意义。3.ELISA结果显示:与对照组相比,模型组中IL-1β、IL-6明显升高;与模型组相比,雷公藤甲素低剂量组、雷公藤甲素高剂量组均可以降低血清中IL-1β、IL-6的表达(p<0.05),差异具有统计学意义。4.HE染色法显示:与对照组相比,模型组衬里层滑膜细胞层数增多,巨噬细胞等炎性细胞浸润,踝关节中关节间隙明显变窄,滑膜、软骨、骨组织分界不甚明显。与模型组相比,雷公藤甲素灌胃治疗后HE病检示滑膜组织增生减轻,炎性细胞浸润减少、骨间隙改善,骨结构相对完整。5.番红固绿染色法结果显示:对照组红色与蓝色对比鲜明,软骨呈红色,其余为蓝色。而模型组中异染色性明显减弱,其中红色明显减弱或者消失;关节软骨边缘模糊不清,红蓝交界处结构可见糜烂。TP灌胃治疗后基质异色性存在,软骨情况稍改善。甲苯胺蓝结果示:对照组中被紫红色着色的软骨、骨细胞完整;模型组红紫蓝色减少,结构破坏。与模型组相比,TP灌胃治疗后软骨情况有所改善。6.组化结果显示:与对照组相比,模型组MMP-3、MMP-9、MMP-13的阳性表达数增多,平均强度增强。与模型组相比,雷公藤甲素灌胃治疗后,MMP-3、MMP-9、MMP-13的阳性表达数稍少,平均强度减弱。7.RT-PCR结果示:与对照组相比,模型组H3K27mRNA的表达明显升高(p<0.05),催化H3K27的甲基化酶EZH2表达升高(p<0.05),具有统计学意义。与模型组相比,雷公藤甲素组H3K27下降(p<0.05),EZH2下降(p<0.05),具有统计学意义。与对照组相比,模型组中催化H3K27去甲基化酶JMJD3下降(p>0.05),无统计学差异。与模型组相比,雷公藤甲素组JMJD3的表达升高(p>0.05),无统计学意义。结论雷公藤甲素降低外周血浆中IL-1β、IL-6的表达,减少滑膜组织中基质金属蛋白酶MMP-3、MMP-9、MMP-13的表达,从而改善CIA大鼠的软骨破坏。下调EZH2的表达,从而影响H3K27的甲基化、调控基质金属蛋白酶可能是TP缓解RA软骨破坏的机制。第二部分:雷公藤甲素对成纤维样滑膜细胞的作用及机制初探目的探讨雷公藤甲素是否通过FLS影响软骨破坏,初步探讨调控H3K27甲基化影响MMPs的表达是否为雷公藤甲素治疗RA可能的机制。方法(1)从同济医院骨科及中医科获得确诊RA的滑膜标本,酶消化法获取原代成纤维样滑膜细胞,取第3-7代用于后续实验研究。(2)用CD68和Vimentin双标记的流式细胞术鉴定FLS细胞。(3)MTT法检测雷公藤甲素对FLS增殖的影响。(4)流式细胞术AnnexinV-FITC检测雷公藤甲素对FLS凋亡的影响。(5)Transwell细胞迁移实验检测雷公藤甲素对FLS迁移的影响。(6)RT-PCR检测FLS中基质金属蛋白酶、H3K27、EZH2、JMJD3的mRNA表达水平。(7)Western Blot检测雷公藤甲素对FLS基质金属蛋白酶及其组蛋白甲基化修饰的影响。结果(1)本实验室提取的原代细胞经连续2代培养后,大部分为典型的梭形细胞,形态均匀。流式结果显示92.5%的细胞Vimentin阳性,CD55阴性,提示所提取的人原代成纤维样滑膜细胞纯度较高,状态尚可,可用于后续进一步实验。(2)MTT法实验结果表明,在雷公藤甲素与FLS共培养24h时,给药浓度为31.625nM时,细胞增殖开始出现明显的抑制作用(p<0.05),差异具有统计学差异。药物作用48h时,小剂量(7.5nM)的雷公藤甲素对FLS细胞的生殖出现显著抑制,有明显的差异(p<0.05),具有统计学意义。我们选取15nM,30nM和60nM浓度梯度,干预24h做后续实验。(3)流式结果显示:体外培养的FLS凋亡率较低,在5%以下,可能认为活化的FLS具有凋亡抵抗;雷公藤甲素处理24h后,与对照组相比,雷公藤甲素高剂量组处理后凋亡明显增多(p<0.05),差异具有统计学意义。(4)Transwell迁移实验结果显示:体外培养的FLS具有迁移的能力,与对照组相比,雷公藤甲素高剂量组处理后迁移明显减少(p<0.05),差异具有统计学差异(5)RT-PCR结果显示:TP可以减少MMP-3、MMP-9中mRNA的表达,这种下调与H3K27的mRNA、EZH2的mRNA下调一致。(6)Western Blot结果显示:TP可以减少MMP-3、MMP-9蛋白的表达,这种下调与H3K27、EZH2的下调平行。结论体外培养的原代成纤维样滑膜细胞仍具有较强的增殖能力、迁移侵袭能力,并伴随一定的凋亡抵抗;TP对FLS增殖活性的抑制呈现时间和浓度依赖性。所选用的中高剂量TP可以促进体外培养的FLS凋亡、抑制FLS的迁移和侵袭。TP下调EZH2,减少H3K27甲基化,减少MMP-3、MMP-9的表达可能是TP抑制软骨破坏的可能机制。