胰高血糖素样肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）)是人体进餐、口服或静脉注射葡萄糖后肠道细胞分泌的一种能引起胰岛素分泌的生理性肽类激素，在体内有多种存在形式。自从80年代被发现以来，通过大量的人体和动物实验已证实，给予外源性的GLP-1时能有效地对胰岛素的分泌、胰高血糖素的分泌、胰岛素原的合成、胃的排空、饮食习惯和非胰岛素依赖的葡萄糖摄取等方面产生影响，是目前公认的体内重要的活性降糖肽，因而对糖尿病尤其是Ⅱ型糖尿病（NIDDM）的治疗具有广泛的应用前景。本课题的研究，主要涉及人源性GLP-1（human GLP-1，hGLP-1）cDNA的克隆、表达及表达产物的纯化，并探索纯化获得的重组hGLP-1（recombinant hGLP-1，rhGLP-1）的生物学活性。由于采用基因工程方法制备rhGLP-1和针对重组GLP-1生物活性的研究尚未见国内外文献报道，因此本研究结果不仅可为产业化规模制备提供技术线路，而且也可为开发rhGLP-1的临床应用提供资料。 课题研究的主要内容包括：（1）hGLP-1cDNA的克隆、表达载体和工程菌株的构建；（2）hGLP-1工程菌的高密度发酵和诱导表达；（3）rhGLP-1及其前体prerhGLP-1（precursor of rhGLP-1）的分离纯化；（4）prerhGLP-1的体外酰胺化修饰；（5）建立动物模型和测定rhGLP-1体内生物学活性。 考虑到hGLP-1在体内主要以hGLP-1（7-36）NH₂和hGLP-1（7-37）两种活性形式存在，本课题分别研究了该两种rhGLP-1的基因工程制备过程及各自在体内的生物学活性。 方法：1．分别合成6个prehGLP-1（7-36）NH₂ cDNA和hGLP-1（7-37）cDNA寡核苷酸片段，用改进的小片段拼接技术，拼接成完整的prehGLP-1（7-36）NH₂cDNA和hGLP-1（7-37）cDNA，构建重组质粒pGEX-prehGLP-1和pGEX-hGLP-1，转化大肠杆菌BL21（DE3）获得高表达工程菌株E.coli BL21（DE3）／pGEX-hGLP-1和BL21（DE3）／pGEX-prehGLP-1。2．摸索合适的诱导表达条件，采用分批培养和补料分批培养相结合的方法，用5L自控发酵罐对工程菌进行高密度培养以大量产 厂l伦又 砰呵｝”W刀】W人馒凸闪闭可w肚一D L抖’二刃’】仍IW闪沁 生融合蛋白OST寸hGLP、人3．高密度发酵培养的菌体超声破碎后，裂解液用 Glutathione Sepharose 4B亲牙层析纯化收集GST融合蛋白，经CNBr裂解、QAE Seonarose FF 柱层析和 RP－C＊柱脱盐，收集 prerhGLP－1（7－36）NH和 rhGLP－l（7－37）。4．CPD－Y催化体夕转肽反应，对 prerhGLP－1（7－36）NH C末端 进行酚胺化修饰。5．大鼠体内降糖活性测定。正常SD大鼠用葡萄糖＊ 八gAity 处理后，在很短时间内血清葡萄糖浓度迅速升高，此时腹腔分别给予一定剂量研＿ 究制备的两种rhGLP刁作为供试品，对其降血糖活性进行比较和分析。同时使用 1型糖尿病大鼠模型对其生物学活性进行研究。 结果与讨论：1．构建的两种重组质粒转化大肠杆菌 BLZI①E3L 挑取单克 隆摇菌，用 BamH、Xho双酶切和 DNA序列测定对重组质粒进行鉴定，筛选出 了具有prehGLP－l（7－36）NH。cDNA和 hGLP－l（7－37）cDNA片段正向插入且与 GST＿ 之间读码框架正确的PGEX叶T0的重组质粒。IPTG诱导4h后，出现明显的诱导＿ 蛋白条带，表达量占茵体总蛋白量的30％～40％。2．采用分批培养和补料分批 培养相结合的技术，控制碳源和氮源的补加，控制溶解氧的量，可使重组工程菌 发酵0．D6。。值达52，发酵菌体内融合蛋白占菌体总蛋白量的28儿融合蛋白总产。量达到每升发酵液2。ig。3·上述发酵工程菌超声破碎、01u（。m士neup他r。s”－ 4B 亲和 纯化后，GST－prerhGLP－l（7－36）NH。融合蛋白纯度大于90％， GST－rhGLP－l（7－37）融合蛋白纯度也在90％以上。两种融合蛋白经CNBr裂解、阴 离子交换柱层析、RP｛；。柱脱盐，收集液用HPLC进行纯化和分析，各自的主峰＿ 纯度大于85儿ESIMS鉴定分子量与理论值相符合。表明上述纯化过程己得到了－－ prerhGLP一l（7一36）NH和 rhGLP一l（7一37）。4．利用 CPD－－Y催化体夕转酞胺化一 应，成功实现了对PrerhGLPl＊刁6）NHz的C末端酚胺化修饰。每隔0．sh取样－ 分析发现，反应在Zh达到峰值，产率大于50％，反应时间延长产率反而下降。 反应产物用 HPLC进行纯化，ESI－－MS测定分子量为 3297．5，与理论计算的分子量 ，相符，证明酚胺化修饰后得到了与天然rhGLP－l（7－36）NH一级结构相一致的产 物。5．采用正常SD大鼠和 1型糖尿病大鼠模型对不同剂量的rhGLP－1体内生 物学活性进行研究。动物实验结果表明：腹腔注射不同剂量的rhGLP叶＊《6)bJHHr－ 和rhGLP、＊七7)，除低剂量外均具有显著和非常显著的促胰岛素分泌和降血糖 活性；两种rhGLPl促胰岛