第一部分 原发性干燥综合征B细胞亚群特点及其调节功能研究背景和目的原发性干燥综合征(primary Sjogren’s syndrome, pSS)是泪腺、唾液腺受累为主的慢性自身免疫性疾病,亦可出现多系统损害。pSS患者B细胞过度活化,导致高免疫球蛋白血症和多种自身抗体产生,唇腺组织大量B细胞及浆细胞浸润。调节性B细胞(regulatory B cells, Breg)是一类具有免疫抑制功能的B细胞亚群,主要通过分泌IL-10等发挥免疫调节功能。pSS患者Breg细胞在外周血和组织中表达异常或功能受损,可能导致了B细胞的异常活化。我们通过分析pSS患者B细胞亚群的主要变化及活化情况,Breg细胞对效应T细胞分化的调控影响,在唇腺组织中的表达情况,滤泡辅助T细胞(T follicular helper,Tfh)能否促进Breg细胞活化,以及Breg细胞与pSS患者临床特点的相关性,以期能够对Breg细胞在pSS发病机制中的作用做以初步阐释。方法共收集84例pSS患者和69例年龄性别匹配的健康对照者(healthy control, HC)外周血以及唇腺组织各8例,用于后续研究。分离pSS患者和HC外周血单个核细胞,流式细胞表面染色分析B细胞亚群比例变化,分析pSS患者B细胞亚群相关活化因子表达差异,利用流式细胞仪分选B细胞亚群进行形态学观察。观察pSS患者Breg细胞IL-10表达情况,流式细胞仪分选pSS患者和HC的Breg细胞,磁珠分选CD4+CD25-效应T细胞,体外进行混合淋巴细胞培养和交叉培养,收集培养上清,利用CBA技术检测培养上清中相关炎性细胞因子水平。利用免疫组化和免疫荧光方法,对pSS患者和HC中CD20、IL-10表达情况进行定性、半定量及共定位分析。流式细胞仪检测pSS患者和HC中Tfh、Tfh-IL-21和Breg-IL-21R表达情况,初步阐释IL-21对Breg细胞的调控作用。最后结合pSS患者临床资料,分析Breg细胞比例和临床特点之间的相关性。结果1.pSS患者外周血Breg细胞占CD19+B细胞比例(9.23±0.45%),较HC(2.55±0.16%)显著升高(p<0.001)；成熟B细胞比例(63.72±1.08%),较HC(56.50±1.14%)显著升高(p<0.001)；记忆性B细胞比例(6.34±0.46%),较HC(19.36±1.03%)显著降低(p<0.001)；CD19+CD24hiCD27+细胞比例(6.05±0.53%),较HC(16.39±1.15%)显著降低(p<0.001)。B细胞三个主要亚群在形态学上无显著性差异。2.pSS患者Breg细胞表面分子CD50、CD44、CD95、TACI表达水平较记忆性B细胞显著下降(p<0.05)；3.pSS患者CD19+B细胞表达IL-10水平为(8.23±1.91%),较HC(25.55±0.63%)显著降低(p<0.001)；Breg细胞IL-10表达水平为(28.43±5.49%),较HC(53.13±7.93%)显著降低(p=0.030)。4.进行混合淋巴细胞培养和交叉培养,培养上清检测结果提示：相较与HC,pSS患者的Breg细胞不能有效抑制其本身或HC的效应T细胞分泌的炎性细胞因子,IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-17、IL-21以及IL-9(p<0.05)。5.在pSS患者的唇腺组织中可见大量CD20+B细胞浸润,而IL-10表达较少,且与HC的IL-10+细胞在唇腺组织中的分布部位存在差异,免疫荧光染色提示pSS患者唇腺组织中仅见少量散在CD20+IL-10+细胞表达。6.pSS患者外周血Tfh细胞比例(占CD4+T细胞)为(21.88±0.82%),较HC(17.91±0.88%)显著升高(p=0.002)；且CD4+CXCR5+PD-1+细胞(占CD4+T细胞)(7.42±0.80%)及CD4+CXCR5+ICOS+细胞水平(19.41±0.91%)亦较HC(1.71±0.12%,16.29±0.84%)显著增多(p<0.001,p=0.016)。pSS患者Tfh细胞IL-21表达水平(27.43±2.94%),较HC(9.97±1.91%)显著升高(p=0.018)。pSS患者Breg细胞IL-21R的表达(62.27±2.43%),较HC(75.25±2.18%)显著降低(p<0.001)。7.分离pSS患者和HC的CD19+B细胞进行体外培养,在加入CD40L和CpG基础上,增加/不增加rh IL-21刺激,观察Breg细胞IL-10表达。体外培养过程中rh IL-21可以显著提高pSS患者和HC的Breg细胞IL-10表达(p<0.05),提示在体内可能有其他因素影响IL-21对Breg细胞的调控。8.在ESR升高、IgG升高、抗SSA抗体阳性、抗SSB抗体阳性、ESSDAI评分提示病情活动的pSS患者Breg细胞比例显著升高。Breg细胞比例与pSS患者ESR、IgG水平呈正相关。结论与HC相比,pSS患者外周血B细胞亚群存在显著性偏倚,Breg细胞比例显著增加,记忆性B细胞比例显著减低,Breg细胞表面活化因子表达与记忆性B细胞存在差异。pSS患者虽然Breg细胞比例增多,但IL-10的表达却显著下降,且不能有效抑制效应T细胞分泌炎性细胞因子。pSS患者Breg细胞在唇腺组织中表达未见明显增多,不能有效抑制和局限炎症反应。pSS患者体内由于Breg细胞IL-21R表达显著下降,Tfh细胞分泌IL-21未能有效促进Breg细胞抑制功能的发挥。pSS患者Breg细胞比例与IgG、ESR、抗SSA/抗SSB抗体以及ESSDAI评分相关。第二部分转录组与microRNA联合分析原发性干燥综合征B细胞活化特点背景和目的原发性干燥综合征(primary Sjogren’s syndrome, pSS)是以口眼干为主要表现的慢性自身免疫性疾病。基因、环境、激素水平、免疫调控等多个环节导致pSS的发生,目前认为干扰素(interferon, IFN)途径和B细胞活化在其中发挥着重要作用,最终形成IFN-B细胞恶性循环,导致了pSS的进展。转录在基因表达调控中起主导作用,对特定条件下细胞中的mRNA水平进行研究,有助于基因表达调控的研究。microRNA (miRNA)可以对mRNA进行调控,影响mRNA的表达,进而影响后续翻译过程,从而对细胞的生长、发育、衰老、凋亡多个方面进行调节。我们利用RNA-seq技术对pSS患者外周血B细胞进行转录组测序,并与健康对照者(healthy control, HC)对比进行基因差异表达及相关信号通路分析,利用miRNA测序结果初步筛选可能参与B细胞转录调控的miRNA,同时将两者结合分析,有效筛选出miRNA可能靶基因位点。方法入组3例pSS患者和3例性别年龄匹配的HC。分离pSS患者和HC的外周血单个核细胞,利用磁珠分选CD19+B细胞,提取细胞总RNA。根据不同需要,构建转录组和miRNA测序所需的cDNA文库,利用RNA-seq技术进行测序。通过比对分析,筛选出pSS患者和HC间差异表达基因和差异表达miRNA,利用GO注释和KEGG pathway进行富集,分析这些差异表达基因或靶基因可能的生物学功能,在pSS发病中的作用。将差异表达基因和差异表达miRNA进行联合分析,筛选出miRNA的可能靶基因。结果1.转录组分析中,将pSS患者和HC的B细胞样本进行比对分析,共筛选出51个差异表达上调基因和22个差异表达下调基因。差异表达上调基因主要包括IFI44L、 IFI44、IFIT1、IFITM1、IFIT3、IFIT2、IRF7、IFI6、ISG15等一系列IFN相关基因,进行GO注释分析发现这些差异表达基因显著富集于显著富集于与IFN相关信号通路及其调节通路上,进行KEGG pathway分析发现,这些基因多集中于微生物感染相关的信号通路上,如流感病毒A、丙型肝炎病毒、麻疹病毒和单纯疱疹病毒感染等途径上。差异表达下调的基因中,比较关键的基因包括ESR2和EGR1,其中ESR2为雌激素受体,EGR1具有抑制细胞生长转化、促进凋亡的作用。2.在miRNA分析中,将pSS患者和HC的B细胞样本进行比对分析,共筛选出5个具有显著性差异表达miRNA,其中1个表达上调,4个表达下调,分别为hsa-miR-4485-3p、hsa-miR-144-5p、hsa-miR-144-3p、hsa-miR-451a、hsa-miR-4732-3p。对这些差异表达的miRNA进行靶基因预测及功能通路分析发现,其显著富集于单纯疱疹病毒感染、TGF-β等信号通路上。3.将差异表达基因和差异表达miRNA进行联合分析,筛选出miRNA可能的靶基因。这些差异表达miRNA的靶基因多参与细胞骨架结构及DNA/RNA合成修饰等相关,如RASD2、CKAP4、SPARS2L和METTL。结论通过转录组和miRNA联合分析,在pSS患者外周血B细胞中筛选出51个差异表达上调和22个差异表达下调的基因。这些上调差异表达基因主要集中于IFN相关信号通路及病毒感染有关通路上,有可能是外界病毒等微生物感染触发了IFN信号通路的级联反应,并最终导致B细胞的活化增殖。ESR2基因表达下调,推测pSS患者雌激素水平减低可能在pSS发病中发挥着一定作用；EGR1基因表达下调影响其抑制细胞增殖活化,促进凋亡的作用,可能导致B细胞持续活化。筛选出5个具有显著性差异表达的miRNA,靶基因主要集中于对B细胞结构和核酸修饰合成等方面,说明pSS患者一些基因的差异表达,miRNA只是其中一种调控方式。第三部分原发性干燥综合征B细胞受体库差异表达研究背景和目的pSS患者B细胞高度活化,可以产生多种自身抗体,大量B细胞、浆细胞浸润至泪腺和唾液腺,5-10%pSS患者可以进展为淋巴瘤。B细胞识别抗原的关键部位是B细胞受体(B cell receptor, BCR),BCR有着特定的互补决定区(complementary determining region, CDR),其中B细胞的CDR3是B细胞结合抗原表位的主要部位,最具多样性和代表性。检测B细胞CDR3受体库,能够分析生理和病理状态下机体免疫状况以及B细胞的发生、发展特点。利用高通量测序技术可以对患者和健康人B细胞的BCR CDR3受体库进行测序和比对分析,评估pSS患者机体BCR CDR3受体库的组成、多样性、各功能基因亚家族的偏向取用和健康人群可能存在的差异。方法提取20例pSS患者和19例性别年龄匹配的健康对照者(healthy controls, HC)外周血单个核细胞,磁珠分选CD19+B细胞,提取基因组DNA,进行多重聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR),2%琼脂糖凝胶回收,上机测序,获取数据并进行生物学分析。结果1.pSS患者CDR3序列平均长度为(53.03±1.68)bp,显著低于健康对照组(55.47±1.52)bp(p<0.001)。2.对pSS患者和健康对照者CDR3多样性比较分析发现,反映免疫组库多样性的D50指数在pSS患者中为(0.217±0.014)显著低于HC(0.229±0.020)(p=0.04),说明疾病组CDR3克隆多样性较对照组明显下降。3.pSS患者和健康对照者V/J基因优势取用分析：pSS患者在V功能性家族性基因中,对IGHV1、IGHV4、IGHV5、IGHV6的取用率显著高于健康对照者,对IGHV3的取用率显著低于健康对照者；pSS患者在J功能性家族性基因中,对IGHJ1、IGHJ2、 IGHJ3的取用率显著高于健康对照者(p<0.05)。4.在BCR CDR3受体库基础上筛选出普遍存在于抗SSB抗体阳性pSS患者外周血B细胞BCR H链的优势取用CDR3序列,进一步与健康对照组比较,发现3种与疾病特征性相关的Share克隆型,这些pSS患者中存在显著富集现象：包括"CARAGMDVW"、"CARGRYYYYGMDVW"、"CAKDNKPLNYDILTGQMNYGMDVW"。结论pSS患者BCR CDR3序列长度和多样性显著低于HC,提示pSS患者中某些B细胞存在特异性克隆扩增可能。pSS患者BCR CDR3的功能基因亚家族V/J基因取用具有偏向性,这些非随机优势取用可能与某些特异性克隆相关。抗SSB抗体阳性的pSS患者BCR CDR3发现3种优势克隆。关于BCR CDR3受体库的进一步深入研究,将有助于发现pSS患者疾病相关B细胞克隆,监测疾病状态下B细胞活化状态,寻找潜在的pSS特异性自身抗原,预防淋巴瘤的发生。