论文部分内容阅读
蛋白质相互作用的研究是阐释基因功能的重要手段。随着蛋白质组学的迅速发展,在不同生物体系中进行的大规模的蛋白质相互作用研究逐步成为生物学领域的一个重要方面。大多数细胞的生物学功能都是由蛋白复合体而非单一蛋白来完成的,所以识别和分析蛋白复合体的组分是研究蛋白功能所必需的。目前用于大规模研究蛋白质间相互作用最常用的方法是TAP和酵母双杂交。MEKK2是细胞中的有丝分裂原激酶家族一类丝/苏氨酸蛋白激酶,广泛分布于各组织中,其中脾脏和外周血细胞中表达高,提示MEKK2在免疫反应中有重要作用,而MEKK2在大部分组织中的功能不明确。MEKK2与多条信号通路有联系,能激活由MEK1/2,MEK3/6、MEK5介导的ERK,p38和ERK/BMK信号通路。还能激活转录因子NF-κB和AP-1,在激活PKC-2信号通路中也有重要作用。本文以全长MEKK2为诱饵,用酵母双杂交和TAP两种方法筛选MEKK2相互作用蛋白。酵母双杂交试验中,将MEKK2克隆到pGBKT7载体中,与293细胞和B细胞文库通过PEG/LiAC法共转化到酵母细胞中,通过营养缺陷培养基筛选阳性克隆。结果显示4-平板出现约2000个克隆,表明这种方法不适合筛选全长MEKK2相互作用蛋白。TAP试验中,选用SBP和CBP标签。将MEKK2克隆到pCTAP载体中后与pSUPER空载体共转染HEK293细胞,使用嘌呤霉素建立稳定细胞系,通过两步亲和纯化得到一蛋白复合物。经质谱鉴定,该蛋白复合物含216个蛋白。经肽段比较和结构分析确定,Mip1、MEK3、MEK6为已知相互作用蛋白,50个为非特异蛋白,另外的163个为可能相互作用蛋白。该研究结果为以后探讨MEKK2的激活机制及深入研究MEKK2的生物学功能奠定基础。