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隐花色素CRY2(cryptochrome2)是植物感受蓝光的光受体之一,它介导了蓝光调节植物的光形态建成反应,如抑制下胚轴的伸长、调节昼夜节律、激活基因转录和调节开花等。Cashmore等人1993年就确定CRY2是植物的蓝光受体,但是直到现在,在蓝光受体CRY2信号传导方面的研究一直没有重大突破；因此,首先有必要通过各种分子生物学与遗传学的方法找到与蓝光受体CRY2相互作用的蛋白,为进一步研究CRY2介导的信号传导途径奠定基础。
本研究首先构建了酵母双杂交载体pBridge—CRY2,然后以pBridge-CRY2作为Bait对构建在Prey载体PACT1中的酵母双杂交文库进行了筛选。通过筛选酵母双杂交文库发现蓝光下CRY2可能与多种蛋白发生相互作用。其中包括生物钟核心振荡器组分蛋白LHY与CCA1,翻译起始因子EIF4E,磷酸酶AT3G51370,以及激酶CKA2和CKI。
本课题重点对CRY与生物钟相关蛋白的相互作用进行了深入研究。通过RT-PCR克隆了CKA2,LHY,CCA1基因,并成功构建了pGADT7-CKA2,pGADT7-LHY,pGADT7-CCA1载体。我们通过营养缺陷型培养试验,滤纸显色反应和液相显色反应检测了在蓝光和黑暗条件下pBridge-CRY2与pGADT7-CKA2,pGADT7-LHY,pGADT7-CCA1在酵母体内的相互作用。结果发现:CRY2蛋白在蓝光条件下与CKA2有较强的相互作用,而与LHY,CCA1的相互作用较弱,而且CRY2与CKA2,LHY,CCA1的相互作用强度与蓝光光强呈正相关；而在黑暗条件下CRY2与所检测蛋白均无相互作用。
成功构建了pColdTF-CKA2,pColdTF-LHY,pColdTF-CCA1原核表达载体,并采用大肠杆菌BL21表达得到了可溶的重组蛋白。然后,利用免疫共沉淀的方法检测了CRY2蛋白与CKA2,LHY,CCA1蛋白之间的体外相互作用。结果表明拟南芥体内的CRY2蛋白能够与原核表达的重组蛋白CKA2,LHY,CCA1在体外相互作用。
采用裂解荧光素酶互补分析系统进一步研究了CRY2蛋白与CKA2,LHY,CCA1蛋白在植物细胞体内的相互作用。实验构建了CRY2-NLUC质粒,CKA2-CLUC质粒,LHY-CLUC质粒和CCA1-CLUC质粒。试验结果表明:CKA2与CRY2蛋白之间的相互作用较强,约为对照组CRY2与COP1蛋白之间作用强度的一半；而CRY2与LHY,CCA1的作用强度较弱,约为对照组CRY2与COP1蛋白作用强度的1/3。