烟曲霉是临床重要条件性致病丝状真菌之一,是引发人类曲霉病的主要菌种。烟曲霉主要感染免疫缺陷人群,其引起的侵袭性曲霉病有很高的死亡率,可达80-95%。近年来由于介入治疗增多和免疫抑制剂的广泛使用,免疫缺陷人群的数量在不断增加,而另一方面不同国家和地区关于烟曲霉对目前临床抗真菌治疗的一线药物,三唑类抗真菌药物,包括伊曲康唑、伏立康唑和泊沙康唑等的耐药的报道,甚至是多重耐药的报道在不断增多,因此发现新的抗真菌治疗靶点和解析烟曲霉耐药机制成为应对烟曲霉感染的研究热点。烟曲霉毒力是由多因素控制的,包括细胞壁组成成分、毒素、过敏原和蛋白酶等,宿主则通过第一道防线,固有免疫,吞噬和释放炎性因子等抑制或清除烟曲霉。其中抵抗外界应激和逃避宿主免疫的能力是影响烟曲霉毒力的关键因素。肌动蛋白骨架在真菌细胞极性生长、产孢、应激和维持细胞形态等方面发挥重要作用,调控其功能的蛋白网络十分复杂,许多结合因子的功能亟待阐明。Cofilin(丝切蛋白)是一种肌动蛋白解聚因子,是肌动蛋白骨架重排的调控核心之一。其可切割肌动蛋白纤丝,当其N末端丝氨酸被磷酸化时,便失去切割活性。在哺乳动物细胞中,Cofilin参与许多生理功能,包括细胞运动、胞质分裂、胞吞胞吐等。在酿酒酵母中,Cofilin是必需蛋白,其点突变影响菌株的生长表型和多重耐药。而烟曲霉Cofilin的功能尚不清楚。因此,本论文的研究目的就是阐明Cofilin在烟曲霉不同生长阶段的表达及其分布规律,并通过改变Cofilin蛋白的表达量、磷酸化状态以及突变关键氨基酸位点探究了Cofilin在烟曲霉生长、胞外应激和毒力中的作用,最终通过这些系统性的研究,为抗真菌治疗提供新的理论依据或可能的新靶点。首先,我们通过RT-qPCR方法确定了Cofilin在烟曲霉萌发阶段(生长8 h时)表达最多。借助于荧光显微镜,我们对Cofilin蛋白融合GFP的菌株进行观察,发现Cofilin蛋白弥漫的分布于胞质中。根据同源重组原理和原生质体转化方法,我们构建了以CEA17ku80Δ菌株为亲本的cofilin条件性敲除株(cofilinteton)、过表达株(cofilin OE)、cofilinS5A突变株和以cofilinteton为亲本的cofilinS5E突变株(cofilinteton/cofilinS5E)。cofilinteton在低浓度多西环素(3?g/ml)存在时Cofilin的表达明显低于亲本菌株;而cofilin OE中的Cofilin表达量始终高于亲本菌株。CofilinS5A突变后,Cofilin不能被磷酸化,模拟持续的激活状态;CofilinS5E突变后,模拟Cofilin持续性磷酸化状态。通过菌株生长实验,我们发现Cofilin是烟曲霉的必需蛋白。Cofilin低表达导致烟曲霉在固体培养基上的生长速率明显下降,菌丝的极性生长受到严重损害,菌落辐射状生长消失;在液体培养基中cofilinteton生长初期常形成章鱼样结构,菌丝分支增多,而且出现胞质泄露,而这种生长抑制很可能是胞质泄露引起的,因为外源加入山梨醇可“拯救”cofilinteton的生长。Cofilin过表达对烟曲霉形态几乎无影响,但在MM固体培养基,28°C培养时cofilin OE的生长速率会明显高于亲本菌株。烟曲霉在不同胞外应激条件的生长实验显示,cofilinteton对荧光白、法尼醇、刚果红敏感性与亲本菌株相比无显著差异,对SDS、H2O2和碱性pH9.0敏感性则显著高于亲本菌株;cofilin OE除了对H2O2的敏感性减弱之外,对其他应激的敏感性与亲本菌株基本无差异。进而,我们发现调节氧化应激基因(catA、cat1、skn7、yap1)和碱性pH的基因pacC在cofilinteton中表达下调,在cofilin OE中表达上调。通过蛋白质印迹实验(Western blot),我们还发现Cofilin过表达激活了高渗透压甘油应激通路,pSakA表达增多,同时SakA激活的3个标记基因catA、dprA和dprB的mRNA表达也增多。通过体内毒力实验,我们发现cofilinteton感染的大蜡螟生存率显著高于亲本菌株,然而cofilin OE感染的大蜡螟和免疫缺陷小鼠(氢化可的松模型和环磷酰胺模型)的生存率与亲本菌株感染的生存率无显著差别,这提示Cofilin可能参与烟曲霉毒力的调节。接下来,我们通过体外实验研究了Cofilin表达改变对烟曲霉与宿主细胞相互作用的影响,结果显示cofilinteton和cofilin OE对肺上皮细胞A549的粘附能力都减弱,Cofilin低表达会引起烟曲霉粘附相关因子medA、stuA和uge3的下调,而Cofilin过表达仅引起stuA的下调。进而,采用制霉菌素保护实验测定两种菌株及亲本菌株对肺上皮细胞A549细胞的侵染能力(即在宿主细胞内的存活能力)发现,Cofilin低表达使烟曲霉侵染A549细胞能力减弱,而Cofilin过表达使烟曲霉侵染A549细胞能力增强。再用3种菌株及它们的培养上清分别刺激A549细胞,通过RT-qPCR方法检测细胞炎性因子MCP-1、IL-8和TNF-α表达水平,结果显示:cofilinteton刺激时,A549细胞MCP-1表达减少;cofilin OE刺激时,A549细胞MCP-1表达增多;但它们的培养上清刺激时,A549细胞MCP-1表达无变化。这说明Cofilin以某种方式影响了宿主细胞炎症因子的释放,而这种表达的改变可能与菌株表面的成分发生变化有关,而与菌株外分泌的物质关系不大。cofilin OE和亲本菌株分别刺激用抗dectin-1抗体封闭的A549细胞,两组细胞表达MCP-1无显著差别。进一步,用免疫荧光方法标记菌株表面多糖,发现cofilin OE表面β-1,3-glucan和多糖共轭物增多,而cofilinteton表面β-1,3-glucan和多糖共轭物减少。这些结果提示cofilin OE刺激A549细胞MCP-1表达增多可能依赖菌株表面β-1,3-glucan的增多。由此,我们进一步用RT-qPCR方法对烟曲霉β-1,3-glucan合成酶和几丁质合成酶家族基因的表达水平进行检测,结果显示cofilinteton的这些基因的确表达下调,cofilin OE中的这些基因表达则上调。有趣的是,蛋白质印迹法结果显示Cofilin低表达显著激活MpkA,使MpkA磷酸化显著增多,而Cofilin过表达则不影响MpkA激活,这提示Cofilin的表达改变显著影响了烟曲霉的极性生长、氧化和碱性pH应激以及毒力,这可能与Cofilin影响了烟曲霉胞壁多糖合成有关,但这种Cofilin影响的烟曲霉胞壁多糖合成可能不依赖MpkA介导的细胞壁完整性信号通路的调控。紧接着,我们研究了Cofilin磷酸化状态改变(S5A和S5E突变)对烟曲霉菌株的影响。首先,CofilinS5A突变对烟曲霉形态和生长速率几乎不影响;CofilinS5A突变后,烟曲霉对细胞壁干扰剂、H2O2和碱性pH的应激敏感性无明显变化;另外,cofilinS5A突变株与亲本菌株对A549细胞的侵染能力和在氢化可的松免疫缺陷小鼠中的毒力都无显著性差别。CofilinS5E突变会抑制菌株生长,如果Cofilin完全磷酸化,烟曲霉菌株无法存活;cofilinteton基础上的CofilinS5E突变(cofilinteton/cofilinS5E)并没有加重cofilinteton在应激方面的表型。这提示Cofilin的磷酸化状态对烟曲霉生存与生长至关重要,过多非磷酸化Cofilin的存在对烟曲霉生理功能的影响可能不大,但具体机制仍需进一步研究分析。最后,为了更加深入研究烟曲霉Cofilin的功能,我们将Cofilin的多个可能重要功能位点进行了定点突变,并提出一种通过构建母版基因突变cassette来实现基因突变的新策略。该策略简单,不需要构建质粒,从而不需要酶切连接、大肠杆菌转化和筛选,节省构建时间,较适用于一次性构建同一个基因多种突变菌株,而且是在基因组原位实现突变。通过该策略,我们构建了3种cofilin突变株cofilinD21A,R21A,cofilinK36A和cofilinE48A,这些位点都是带电荷的氨基酸。研究发现cofilinD21A,R21A,cofilinK36A菌株与亲本菌株比较,产孢减少,色素增多。用荧光白染色菌丝,显微镜下观察发现cofilinK36A菌丝显著膨胀。通过成株实验,我们发现cofilinD21A,R21A和cofilinK36A突变株对伏立康唑和伊曲康唑的敏感性显著减弱,cofilinE48A突变株仅对伏立康唑的敏感性减弱。制霉菌素保护实验则显示,3种cofilin突变株对A549细胞侵染能力都显著低于亲本菌株。但是,3种突变株对氢化可的松免疫缺陷小鼠的毒力与亲本菌株比较无显著差别。这三种突变株调节耐药性及侵染能力的可能机制将在进一步研究中阐明。综上所述,本论文研究较为系统地分析阐明了Cofilin在烟曲霉极性生长、抵抗应激以及毒力等中的功能及可能的调控机制,在烟曲霉中发现了肌动蛋白骨架调节蛋白与细胞壁应激响应机制及毒力间的联系;鉴于烟曲霉Cofilin与人同源蛋白的亲缘关系较远,本研究也为抗真菌治疗提供了新的理论依据和可能的药物靶点。另外,我们的研究还建立了一种新的烟曲霉基因突变策略,为筛选烟曲霉重要蛋白的关键氨基酸和研究蛋白结构与功能间关系提供了极大的方便。