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迄今为止,在细菌中已发现九种蛋白分泌系统,参与细菌的营养吸收、吸附、致病性等多种生命过程,包括2010年在Porphyromonas gingivalis和Flavobacterium johnsoniae中发现Ⅸ型分泌系统-Type Ⅸ secretion system（T9SS）。T9SS由一系列的Por、Gld、Spr蛋白组成,广泛分布且仅存在于拟杆菌门中,参与致病性、细胞滑动和生物大分子的降解。含有N端信号肽和保守的C-terminal domain（CTD）的T9SS底物蛋白首先经Sec系统跨内膜转运至周质空间,后经T9SS识别,跨外膜转运至细胞表面或胞外。据报道,大部分的金属离子可通过孔蛋白以被动扩散的方式跨外膜转运,进而被菌体吸收利用。当胞外的金属离子浓度较低时,以被动扩散方式转运的金属离子往往不能满足胞内需要。在金属离子匮乏的情况下,一些细菌可跨外膜主动转运金属离子（如Burkholderia thailandensis中锌离子的转运）。Cytophaga hutchinsonii是广泛分布在土壤中的革兰氏阴性细菌,属拟杆菌门。C.hutchinsonii可快速高效地降解结晶纤维素,其降解机制不同于好氧真菌的游离纤维素酶系机制和厌氧细菌的纤维小体机制,Wilson推测其采用第三种纤维素降解机制。另外C.hutchinsonii无鞭毛和Ⅳ型菌毛,可在介质表面快速地滑动,其运动机制也是未解之谜。近年来的研究表明外膜蛋白在纤维素降解和滑动中发挥着重要的作用。C.hutchinsonii 基因组中含有全套的T9SS编码基因。研究报道CHU3237（PorU）和CHU—0170（SprP）是C.hutchinsonii T9SS的组分,影响纤维素降解和滑动,尚未有研究报道T9SS其他组分（尤其是核心组分）的功能。本文改进了 C.hutchinsonii T9SS突变株的筛选条件,获得了 T9SS核心组分GldN以及重要组分SprA和SprT编码基因的敲除株。另外鉴定了两个未知功能蛋白为C.hutchinsonii T9SS的组分。通过研究各T9SS组分的功能,首次发现T9SS参与低浓度条件下钙离子和镁离子吸收。具体研究内容以及取得的主要结果如下:C.hutchinsonii T9SS核心组分蛋白GldN的功能研究:拟杆菌门T9SS的编码基因中,gldK、gldL、gldM、gldN的分布比较保守,在基因组中连续分布且转录方向一致。研究表明GldK、GldL、GldM、GldN可形成跨细胞膜的蛋白复合体,为T9SS的核心组分。为了研究C。hutchinsonii中GldN的功能,我们改进了突变株的筛选培养基,在完全培养基（PY6）中添加0.9mM钙离子和0.8 mM镁离子,命名为PYT培养基。用PYT和同源重组技术成功地敲除了gldN,得到△gldN突变株。研究发现GldN在纤维素降解、菌体滑动和CTD蛋白分泌过程中均发挥着关键作用。gldN敲除后,突变株的纤维素降解能力完全缺失,既不能降解结晶纤维素,也不能降解无定形纤维素。同时,△gldN的运动能力完全缺失,在硬琼脂和软琼脂上不扩散,个体细胞在玻璃表面的附着能力降低且失去滑动能力。CHU0344是C.hutchinsonii分泌的主要胞外蛋白,含有CTD,其分泌在△gldN中发生缺陷。另外,通过细胞表面蛋白组学在野生株（WT）的细胞表面鉴定到38个CTD蛋白,而△gldN的细胞表面缺失了其中的35个,包括CHU3220,其是纤维素结晶区降解必需蛋白。蛋白免疫印迹实验进一步证明CHU3220在△gldN中分泌缺陷,并在△gldN的周质空间积累。我们首次发现在钙、镁离子含量低的条件下,GldN参与钙、镁离子的跨外膜转运。研究发现△gldN在钙离子和镁离子缺少的培养基中生长能力显著减弱,且胞内钙离子和镁离子的浓度明显下降。通过分析外膜差异蛋白,发现gldN的敲除影响了外膜外排泵蛋白CHU2807在外膜上的定位。敲除chu2807后同样导致突变株在缺乏钙离子和镁离子的培养基中生长能力显著减弱,并且△2807胞内的钙离子和镁离子浓度也有一定程度的降低,表明CHU2807参与低浓度条件下钙离子和镁离子的吸收。目前关于细菌中阳离子跨外膜转运机制的研究报道非常有限,特别是钙离子和镁离子的转运机制。我们的研究首次发现T9SS参与钙离子和镁离子的跨膜转运,揭示了蛋白分泌系统与离子转运系统的联系。以上研究结果表明GldN是C.hutchinsonii T9SS的核心组分,在绝大多数CTD蛋白的分泌、离子吸收、纤维素降解和菌体滑动中发挥着关键作用。C.hutchinsonii T9SS重要组分SprA和SprT的功能研究:SprT（PorT）是最早被发现的T9SS组分,在P.gingivalis参与牙龈蛋白酶的分泌,并在F.johnsoniae中参与SprB、RemA、ChiA的分泌。随后发现Sov（SprA）也参与牙龈蛋白酶的分泌。最近的研究表明SprA是T9SS位于外膜的易位子。SprA由36个β-折叠片形成桶状结构,最大直径为70 A,足以容纳折叠完成的大分子量蛋白通过。为了鉴定C.hutchinsonii中SprA和SprT的同源蛋白,并研究它们在C.hutchinsonii中的功能,我们敲除了 C.hutchinsonii中sprA和sprT的同源基因chu0029（sprA）和chu2709（sprT）。研究发现sprA和sprT的敲除转化子用完全培养基（PY6）培养无法获得,而用富含钙离子和镁离子的培养基（PYT）培养时可成功获得。进一步的研究表明在缺乏钙离子和镁离子的条件下,SprA和SprT参与钙离子和镁离子的吸收,尤其是SprT。在PY6,Stanier不添加CaCl2和Stanier减少MgSO4添加量（自0.8 mM减少至0.1 mM）的培养基中△sprT生长严重缺陷。而在富含钙离子和镁离子的PYT和Stanier培养基中△sprT的生长状态良好。生长曲线结果表明SprT在钙离子和镁离子的胞内转运过程中发挥着不可替代的作用。敲除sprA和sprT后,突变株失去结晶纤维素和无定形纤维素的利用能力。另外,△sprA和△sprT失去纤维素吸附能力,不能在滤纸纤维上有序排列。同时△sprA和△sprT的群体扩散能力和个体细胞的运动能力也完全缺失。上述研究结果表明SprA和SprT在跨外膜转运纤维素降解相关蛋白,纤维素吸附蛋白和粘附素的过程中发挥着重要的作用。△sprA和△sprT分泌CHU0344和细胞表面纤维素酶Ce19A缺陷,且CHU0344和Cel9A在其周质空间积累,进一步证明SprA和SprT是T9SS组分,参与蛋白分泌。分析细胞表面蛋白组学发现△sprA和△sprT的细胞表面分别缺失了32和27个CTD蛋白（在WT的细胞表面鉴定到38个CTD蛋白）。以上研究结果表明SprA和SprT是C.hutchinsonii T9SS的重要组分,参与多数CTD蛋白的分泌、离子吸收、纤维素降解和菌体滑动。C.hutchinsonii T9SS其他组分及调控系统PorX-PorY的功能:为了进一步研究C.hutchinsonii T9SS的组成,我们鉴定到两个未知功能蛋白CHU2991和CHU3410 参与 CTD 蛋白 CHU0344 的分泌,为 C.hutchinsonii T9SS 组分。△2991不能利用纤维素利用,而且在软琼脂上的群体扩散能力部分缺陷,推测CHU2991影响了纤维素降解相关蛋白和部分运动相关蛋白的分泌。CHU2991是C.hutchinsonii中首个被发现部分参与群体扩散的T9SS组分,说明CHU 2991不是T9SS核心组分。CHU一3410是C.hutchinsonii中新发现的T9SS组分,在纤维素利用和运动方面均发挥着关键作用。研究发现CHU3410参与钙离子的胞内转运。△3410仅可在Ca2+含量丰富的培养基中生长。深入研究CHU3410的功能有助于阐明C.hutchinsonii的钙离子转运机制。另外我们研究了 T9SS调控系统PorX-PorY在C.hutchinsonii中的功能。研究发现敲除其编码基因后,突变株纤维素降解能力部分缺陷,菌落扩散能力正常,在钙离子和镁离子缺乏的培养基中无显著生长缺陷,说明PorX-PorY在C.hutchinsonii中未参与多种生理过程。T9SS核心编码基因敲除后,敲除株在PY6培养基中生长能力弱,这是一直以来难以获得△gldN,△sprA和△sprT等突变株的主要原因。我们通过改进T9SS敲除株的筛选条件,用富含钙离子和镁离子的PYT培养基,成功筛选到T9SS敲除株。本文首次发现C.hutchinsonii T9SS不仅参与纤维素降解和菌体滑动,还参与钙离子和镁离子的跨外膜转运,揭示了蛋白分泌系统和离子转运系统的密切联系。另外,本研究发现不同T9SS组分在蛋白分泌和离子吸收过程中发挥的作用不同。我们的研究结果表明T9SS在拟杆菌门中的功能多样性,可为其他细菌T9SS的研究提供了一些研究策略和方法。