目的:探讨转录-翻译相关酶和蛋白因子对无细胞蛋白合成(cell-freeprotein synthesis,CFPS)系统的影响,并对CFPS系统进行优化,结合该系统和脂质体构建一个CFPS-脂质体系统用于胰岛素原的表达,为进一步开发胰岛素口服肠道输送系统奠定基础。方法:利用聚合酶链式反应、酶切、酶连、转化等技术构建T7噬菌体来源的RNA聚合酶及大肠杆菌来源的翻译相关酶和蛋白因子的组氨酸标签重组表达质粒。利用重组蛋白过表达技术在大肠杆菌中过表达、利用Ni-NTA亲和柱纯化这些转录-翻译相关酶和蛋白因子。纯化所得蛋白的浓度使用BCA蛋白浓度测定试剂盒来测定。制备大肠杆菌抽提物,通过补充蛋白合成底物和能量物质构建CFPS系统。采用增强型荧光蛋白(EGFP)作为模式蛋白,构建该蛋白的重组表达质粒作为外源DNA用于CFPS系统合成EGFP中。利用滴定的方法分析纯化的转录-翻译相关酶和蛋白因子浓度对CFPS系统合成效率的影响。筛选其中对CFPS系统合成EGFP具有提高作用的酶和蛋白因子,组合后补充到CFPS系统中,进一步对该系统进行优化。通过合成超折叠荧光蛋白(sfGFP)和胰岛素原-EGFP融合蛋白,检测该优化CFPS系统的通用性。通过质粒构建、蛋白过表达和蛋白纯化方法获得通道蛋白α-溶血素。通过膜染色和共聚焦显微镜观察比较手摇法、超声法、膜挤出法和水-油转移法制备的脂质体的形态、大小、均一性和稳定性。选用水-油法转移法制备脂质体包裹CFPS系统,表达胰岛素原融合蛋白,利用纯化的α-溶血素对脂质体造孔形成通道,比较有无通道的CFPS-脂质体系统表达胰岛素原融合蛋白的差异。结果:成功表达和纯化了 30种转录-翻译相关酶和蛋白因子,包括3个起始因子(IF1,IF2和IF3)、3个延伸因子(EF-G,EF-Tu和EF-Ts)、终止相关的2个释放因子(RF2,RF3)和核糖体循环因子(RRF)、18个氨酰基-tRNA合成酶(除苯丙氨酸-tRNA合成酶和颉氨酸-tRNA合成酶)、甲硫氨酰基-tRNA转甲酰酶(MTF)、RNA解旋酶以及T7RNA聚合酶(T7RNAP)。通过对30种转录-翻译相关因子的滴定分析确定了 T7 RNAP、天冬氨酸-tRNA 合成酶、半胱氨酸-tRNA 合成酶、IF2、IF3、EF-Tu、EF-Ts、EF-G、RF2、RF3和RRF这11种酶和蛋白因子均能提高CFPS系统合成EGFP的效率,IF1明显抑制CFPS系统合成效率,其余酶和蛋白因子则对CFPS系统无明显影响。而T7 RNA聚合酶、RRF、IF2、IF3和EF-Tu组合后则将CFPS合成EGFP的效率优化提高到对照CFPS的2.5倍。同时,优化的CFPS系统对sfGFP的合成效率提高到3倍,对胰岛素原-EGFP融合蛋白的合成效率提高到2倍多,证实该优化CFPS系统的通用性。成功表达和纯化了通道蛋白α-溶血素。多种制备方法中,水-油转移法制备的脂质体在镜下表现出较分散、均一、大小合适的特性,且不影响包裹蛋白的活性。用水-油法制备脂质体包裹CFPS系统,实现了胰岛素原-EGFP融合蛋白及胰岛素原-mcherry融合蛋白在脂质体内的表达。而α-溶血素的引入增加了脂质体内CFPS系统反应过程中底物的供应,使胰岛素原融合蛋白的表达量增加。结论:CFPS系统可以通过补充T7RNA聚合酶、RRF、IF2、IF3和EF-Tu进行优化,从而提高其合成蛋白的效率。利用脂质体可以包裹CFPS系统,在脂质体双分子膜结构保护下的实现胰岛素原表达。