银杏(Ginkgo biloba)又名白果、公孙树，新生代第四纪冰川期的孑遗植物，为我国独存的珍稀名贵树种。我国是银杏的故乡，银杏与大熊猫一样，已被世界各国公认为中国代表。银杏被称为“活化石”，植物学家常把银杏与“恐龙”相提并论，在生物的起源、进化等研究方面提供了理想的试材和有力证据，具有重要的科学研究价值。银杏的经济价值很高，随着银杏产业的发展，银杏在食品、保健、医药、木材、绿化等领域得到广泛的开发利用，然而银杏童期长，实生苗20-30 a才能开花结果，常规育种周期较长，严重影响了银杏的品种改良。目前LEAFY基因被认为是诱导植物开花的枢纽基因，其过量表达可以促进植物提早开花。研究银杏LEAFY同源基因的时空表达模式有助于我们初步认识LEAFY同源基因的功能。通过组织培养、遗传转化等方法从分子水平对其进行改良，可以开辟银杏育种新途径。 我们通过实验获得了以下研究成果： 1．裸子植物银杏组织培养分化特别困难，分别以银杏胚乳、胚、胚轴、子叶以及不同采收期的未成熟胚为外植体，研究了在不同培养条件下愈伤组织和胚状体的发生条件，建立了MK新型培养基配方，结果显示，只有未成熟胚及其胚轴、子叶能够产生胚状体。大于3mm的未成熟胚，在MK+NAA 1 mg/L+BA 1 mg／L培养基上胚状体诱导率最高，达到53.6％，最多的一块愈伤组织形成多达38个胚状体；胚轴最佳诱导条件为：MK+NAA 1 mg／L+BA 1 mg/L，诱导率为45.3％；子叶最佳诱导条件为：MK+NAA 1.5 mg／L+BA 1 mg／L，诱导率为12.9％。暗培养不利于胚状体的发生。不同采收期的未成熟胚愈伤组织和胚状体的诱导率不同。 2．在国内外首次把胚状体培育成苗，建立了银杏组织培养再生体系。利用银杏未成熟胚诱导的胚状体在无菌的条件下，接种在添加不同浓度的活性炭、蔗糖、椰汁的MK培养基上，胚状体可以发育成苗。其中在MK培养基上添加3 g／L活性炭，有10％胚状体生长成苗。在MK培养基上添加40 g／L蔗糖，有19.2％胚状体生长成苗。在MK培养基上添加10%椰汁对胚状体生长发育的促进效果最好，有34.5%的胚状体生长成苗。 3.通过对传统CTAB提取RNA的方法进行适当改良，建立了银杏等木本裸子植物RNA的提取方法。提高提取缓冲液中的p一琉基乙醇的含量，有效地去除了多酚类物质对银杏RNA提取的影响;在研磨过程中，适当加入聚乙烯毗咯烷酮 (PVP)，防止了酚类物质被氧化，从而获得了高质量的银杏RNA样品。经紫外分光光度计、琼脂糖凝胶电泳分析，RNA完整性好、不降解、杂质少、纯度高，同时也适用于反转录、、RT一PCR和Northern杂交等研究，为银杏的分子生物学研究奠定了基础。 4.LEA那基因是调控植物开花的关键基因，裸子植物银杏童期长，也许是由LEAFy同源基因所决定的，我们利用同位素标记，制备Gin妙和Gin从梅两个特异探针，进行Northern分子杂交，对银杏还没有开花功能的幼树、已开过花的银杏成年雄株和雌株的根、茎、叶以及幼果、不同时期的雌花芽、雄花芽进行了LEA那同源基因的表达分析，发现银杏乙州Fy同源基因Gin势在各部位都有表达，属组成型表达，而另一个同源基因GinNdlJ笋只在银杏雌花芽、雄花芽和叶片中表达，属特异性表达。由此可知，银杏双拷贝乙别那同源基因中的GinN’lly基因与银杏开花关系更为密切，同时也与叶片的发育有关，这也许是银杏长期进化的结果。 5.进行了胚愈伤组织遗传转化的研究。通过卡那霉素筛选、PCR鉴定、Southern杂交分析，证明乙EAFy基因己成功的整合到银杏胚愈伤组织基因组中，进一步证明裸子植物银杏可以利用根癌农杆菌介导法进行遗传转化。研究了影响根癌农杆菌转化效率的因素。其中侵染的根癌农杆菌菌株、菌液浓度、共培养时间、抽真空时间以及添加乙酞丁香酮等，对愈伤组织转化效率都有影响。根癌农杆菌菌株EHA 1 05对愈伤组织的转化效率高于GV3lOI;根癌农杆菌菌株EHAIOS培养到对数生长期后，稀释10倍使用，共培养3天，可以获得较好的转化效果，转化率可达38%;加入300 p mol乙酞丁香酮，转化率可以升高到48%;而且浸泡5 min后，抽真空10min，再浸泡5 min比单纯浸泡20 min的处理转化效率局。