【摘 要】
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背景:癫痫是一种高发病率的神经系统疾病,其反复发作给患者造成身体和心里上的严重伤害。癫痫的病理生理机制包括突触传递异常、离子通道异常、炎症、胶质细胞增生等,其中神经递质及囊泡转运在突触传递中发挥关键作用,因此,进一步研究影响突触传递异常的分子机制对于探索其病理生理机制及新的抗癫痫药物靶点是很重要的。研究表明含有 DENN 结构域的蛋白 5B（DENN domain containing 5B,DE
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背景:癫痫是一种高发病率的神经系统疾病,其反复发作给患者造成身体和心里上的严重伤害。癫痫的病理生理机制包括突触传递异常、离子通道异常、炎症、胶质细胞增生等,其中神经递质及囊泡转运在突触传递中发挥关键作用,因此,进一步研究影响突触传递异常的分子机制对于探索其病理生理机制及新的抗癫痫药物靶点是很重要的。研究表明含有 DENN 结构域的蛋白 5B（DENN domain containing 5B,DENND5B）是一种鸟嘌呤核苷酸交换因子（Guanine nucleotide exchange factor,GEF）,参与介导囊泡转运、神经可塑性及脂代谢调节等过程,已有实验及相关临床研究报道DENND5B可能与癫痫的发生发展有关。然而,DENND5B在癫痫中的表达以及对癫痫发作的影响尚不清楚。目的:检测海人酸（Kainic Acid,KA）和戊四氮（Pentetrazole,PTZ）小鼠模型,癫痫发作后海马和皮层组织中DENND5B蛋白水平的变化及脑区定位;并进一步探讨DENND5B在癫痫发作中的作用。方法:采用KA海马注射和PTZ隔日腹腔注射分别诱导小鼠慢性癫痫模型、免疫印迹检测蛋白表达变化、免疫荧光蛋白脑区定位、海马立体定位注射慢病毒干预蛋白表达以及在体多通道记录小鼠脑电活动等方法。1.成年健康雄性C57BL/6小鼠,海马注射KA后诱导慢性癫痫模型,分为有自发性发作（Spontaneous recurrent seizure,SRSs）组和无自发性发作（non-SRSs）组;腹腔注射PTZ,隔天一次,共十五次,分为点燃成功组和未点燃成功组。2.用免疫印迹方法检测癫痫组和对照组海马和皮质中DENND5B的蛋白表达变化,免疫荧光检测DENND5B的脑区定位。3.成年健康雄性C57BL/6小鼠随机分成四组:干扰空病毒组（Con-shRNA）、干扰病毒组（LV-shDEN5）、过表达空病毒组（Con-LV-DEN5）、过表达组（LV-DEN5）,分别行慢病毒海马立体定位注射。4.采用免疫印迹、免疫荧光技术检测慢病毒转染效率。5.慢病毒注射3周后行和PTZ和KA两种慢性癫痫模型造模,PTZ模型小鼠观察:每次注射后30分钟内癫痫发作的等级;KA模型小鼠观察:慢性期SRSs情况,统计潜伏期、持续时间,在体多通道技术记录小鼠脑电活动、评估自发性发作严重程度。结果:1.免疫印迹结果显示,与对照组相比,DENND5B在两种癫痫模型小鼠皮质及海马中表达均降低（*P＜0.05）。2.免疫荧光结果显示,DENND5B主要表达在海马区域,与神经元共定位,与星形胶质细胞不共定位。3.慢病毒载体 Con-shRNA、LV-shDEN5、Con-LV-DEN5、LV-DEN5在海马立体定位注射3周后,免疫荧光结果显示在海马齿状回区域及CA3区域均有GFP阳性表达。免疫印迹结果显示,LV-shDEN5组光密度（optical density,OD）值较对照组明显降低（*P＜0.05）,LV-DEN5组OD值较对照组明显增加（*P＜0.05）。4.PTZ慢性点燃过程中,LV-shDEN5组各时间点平均发作分级明显高于对照组,而LV-DEN5组则明显降低（*P＜0.05,**P＜0.01）;生存分析结果显示,LV-shDEN5组生存率明显降低,而LV-DEN5组则明显升高（*P＜0.05）。5.在KA诱导的慢性癫痫模型中,LV-shDEN5组SRSs潜伏期较对照组明显缩短,而LV-DEN5组则明显延长（*P＜0.05）;相较于照组,LV-shDEN5组SRSs的总持续时间明显延长,而LV-DEN5组的总持续时间明显缩短（*P＜0.05）。结论:1.DENND5B在KA和PTZ模型慢性期皮层和海马组织中表达较对照组显著降低,说明DENND5B可能参与癫痫发作过程。2.通过慢病毒介导下调海马DENND5B后,促进KA和PTZ模型的癫痫发作易感性及严重程度,而LV-DEN5上调海马DENND5B表达后,在两种癫痫模型中观察到相反结果;表明DENND5B可能参与癫痫发作的调控。
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