拟南芥FRS5基因的克隆及功能分析

来源 :湖南农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:bright_123456789
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拟南芥中FRS(FAR1-RELATED SEQUENCES)-FRF(FRS-RELATED FACTOR)家族成员的研究始于光敏色素A(Phy A)信号通路的探究。部分家族成员参与光信号转导调控、茎端分生组织维持、花分生组织决定、开花时间及分枝调控等的功能陆续有报道。本研究对FRS-FRF家族成员FRS5的T-DNA插入突变体表型进行分析,采用RT-PCR和qRT-PCR检测FRS5的表达情况,通过回复试验和超表达试验分析FRS5基因的功能,构建不同结构域组合的表达载体,检测WUS、CLV3和STM的表达变化并对杂交获得的双突变体进行表型分析。主要研究结果如下:1.通过PCR及RT-PCR鉴定获得了FRS5的三个纯合敲除突变体:frs5-1,frs5-2和frs5-3。经表型观察和数据统计发现,三个frs5突变体表型一致,较野生型真叶发生迟缓、叶展小、植株矮小、晚花且莲座叶分枝增多。最早观察到frs5突变体与Col野生型出现明显表型差异是在培养7 d后,推测FRS5可能在莲座叶发生前通过影响茎端分生组织调控植株生长发育。2.采用qRT-PCR检测到FRS5在成熟种子中表达量最高,约为莲座叶中30倍;在花序和幼嫩角果中表达量相对较高,均达莲座叶中两倍水平;在莲座叶、茎生叶、根和茎中表达量相近且偏低。同时构建了pFRS5::GUS质粒并转化至Col中,筛选到3个纯合株系,可用于进一步GUS染色分析。通过GUS染色发现,6 d龄苗中FRS5在茎尖表达量最高。3.将35S::FRS5cds质粒转化至frs5-1中并筛选得到纯合株系,经表型观察及统计分析发现35S::FRS5cds/frs5-1植株的莲座叶发生速度、叶片大小、抽薹时间及株高均已回复至野生型水平。同时也构建pFRS5::FRS5质粒并转化至frs5-1中,初步观察结果表明其表型已回复至野生型水平。4.将35S::FRS5cds转化至Col中获得5个转基因株系,通过qRT-PCR检测发现其中4个株系的FRS5转录水平高于野生型。进一步分析表型发现FRS5过量表达导致拟南芥营养生长阶段后期叶片发生速度稍微下降,叶展稍小,明显晚花且莲座叶分枝减少。5.根据结构域的分布,将FRS5的cDNA序列拆分为不同长度扩增,构建了4个相应超表达载体并成功转化至农杆菌中,为进一步探索FRS5实现功能的关键结构域奠定了基础。6.通过qRT-PCR检测发现FRS5缺失导致WUS、CLV3及STM的表达量显著下调,而FRS5超表达导致WUS、STM下调和CLV3上调。同时将frs5-1和WUS::GUS、CLV3::GUS和STM::GUS分别杂交,并通过GUS染色初步观察发现frs5-1中CLV3和STM表达明显减少。
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