目的明确不同病毒载量下小鼠感染状态的差异,判断HCMV pp65特异性抗体测定在HCMV原发感染诊断中的意义,并同时对临床收集的拟诊HCMV原发感染的89例患者血清标本和尿标本进行系统检测,探讨pp65抗体检测在HCMV原发感染诊断中的作用;并由此提出原发感染的初步诊断标准,为临床应用提供依据。方法(一) pp65重组蛋白为抗原(以下简称“pp65诊断试剂”)检测抗体的评价:对本室血清库中保存的确认标本,采用间接ELISA法检测其特异性IgG抗体,判断本研究所用pp65诊断试剂的灵敏度和准确度。(二)小鼠模型检测:将经空斑纯化后的HCMV AD169株通过空斑形成试验测定病毒感染量。实验组:每组小鼠6只,共5组,分别以1.45×106PFU/ml(A组)、1.45×105PFU/ml(B组)、1.45×104PFU/ml(C组)、1.45×103PFU/ml(D组)、1.45×102PFU/ml(E组)五个不同剂量病毒悬液腹腔注射6～8周龄SPF级BALB/c雌性小鼠,1.0ml/只;同时设立HF阴性对照组(F组):6只,1ml同株HF细胞悬液腹腔注射6～8周龄SPF级BALB/c雌性小鼠;灭活病毒对照组(G组) :6只,1.45×106PFU/ml剂量病毒悬液56℃30min灭活后腹腔注射6～8周龄SPF级BALB/c雌性小鼠。各组小鼠在屏蔽系统中饲养,于接种病毒后1个月取各组小鼠进行一系列检测,用不同的方法检测如下指标:1.血清ELISA检测,采用间接ELISA法检测血清标本中HCMV pp65特异性IgM抗体,尿素变性间接ELISA法检测pp65 IgG-AI,判断小鼠的感染状态。pp65 IgM抗体阳性、IgG-AI<50%则判断为原发感染状态。2.病毒分离:各组小鼠均取脑、肺组织匀浆接种人胚成纤维细胞(HF)细胞,观察4～8w,检测小鼠脑及肺组织中有无感染性病毒颗粒存在,计算其阳性率。3.PCR及RT-PCR:检测小鼠脑及肺组织中HCMV UL83、UL65基因及其相应的转录产物。4.HE染色:观察各组小鼠脑及肺组织的病理改变。同时,对本室保存的12份小鼠模型血清进行检测,该批小鼠模型为HCMV潜伏感染后经环磷酰胺(CTX)再激活,分别检测其pp65特异性IgM抗体和IgG-AI。(三)临床标本检测:从临床收集89例患者的血清和尿标本,分别以pp65诊断试剂以及HCMV全病毒为抗原,测定其特异性IgG-AI和IgM抗体,并将其与意大利DIESSE公司HCMV特异性抗体检测试剂盒结果进行比较;尿标本常规处理后接种HF细胞进行病毒分离,观察HCMV特异性细胞病变效应(CPE),间接免疫荧光试验检测细胞玻片pp65抗原,PCR试验检测细胞培养物UL83基因。病毒分离结果同血清学方法进行比较。结果(一)pp65诊断试剂的评价结果:用pp65诊断试剂检测本室保存的已确认的阳性、阴性血清特异性IgG抗体,均与原确认结果相同,提示本研究所用诊断试剂灵敏度和准确度均可达100%。(二)小鼠模型检测结果:A组和B组小鼠在注射病毒1个月内均可表现为原发感染状态,脑、肺组织中均检测出感染性病毒颗粒,组织可见有明显病理学变化;余5组各项检测结果均未检测到病毒感染。各项检测结果如下:(1)血清学抗体检测:A组和B组小鼠在注射病毒1个月后检测pp65 IgG、IgM抗体均阳性,IgG-AI<50%;余各组小鼠在1个月检测pp65特异性抗体均阴性,未测IgG-AI。(2)病毒分离:A组和B组小鼠在1个月检测,脑、肺组织中均可检出感染性病毒颗粒,感染率100%;余各组检测病毒分离结果阴性。(3)PCR及RT-PCR检测小鼠脑、肺组织中HCMV UL83、UL65基因及其相应的转录产物:A组和B组小鼠在1个月检测脑、肺组织,均可检测HCMV UL83及UL65 DNA,且其相应的转录产物亦为阳性;余各组小鼠未检测到相关基因。(4)HE染色:A组和B组小鼠在1个月检测,脑组织中主要表现为细胞水肿、胞质疏松、细胞层数减少等,同时可见炎性细胞浸润;余各组小鼠检测其脑、肺组织无明显急性炎症性病理改变。对12份潜伏再激活的小鼠血清检测结果显示,其中有4份小鼠血清检测其pp65 IgM抗体为阳性,pp65 IgG均为阳性,且检测其AI值均>60%。(三)临床标本检测结果:89例患者尿标本中,有5例患者尿标本病毒分离试验的HF细胞出现CPE,PCR以及间接免疫荧光鉴定结果均为阳性。pp65诊断试剂检测pp65 IgM抗体阳性标本共22份,阳性率为24.72%;pp65 IgG抗体阳性标本共83份,阳性率为93.26%。在检测的83份pp65 IgG阳性标本中,IgG-AI<50% 17份,即原发感染率19.10%;50%~60%之间24份,即可疑原发感染率26.97%;>60% 42份。HCMV全病毒为抗原检测,IgM抗体阳性标本共25份,阳性率为28.09%;IgG抗体阳性标本共82份,阳性率为92.13%。参比试剂盒检测,IgM抗体阳性标本共21份,阳性率为23.59%;IgG抗体阳性标本共87份,阳性率为97.75%。统计学分析三种方法检测IgG抗体结果,pp65诊断试剂与HCMV全病毒为抗原检测结果存在差异,但与参比试剂盒检测结果比较,无明显差异;且pp65诊断试剂检测灵敏度与准确度均较高。pp65诊断试剂对pp65 IgG阳性标本的AI值进行检测,AI<60%标本共41例,阳性率为46.07%,较参比试剂IgM检测阳性率(23.59%)高;5份明确诊断HCMV活动性感染的患者血清标本中,pp65诊断试剂与参比试剂检测其IgG抗体,各有4份阳性,一致率为100%,pp65诊断试剂检测AI值为阳性的标本有3份,其中,参比试剂检测IgM为阳性的仅有1份。结论(一)我们首次建立了HCMV AD169株原发感染BALB/c小鼠模型,同时采用尿素变性间接ELISA法检测HCMV pp65 IgG-AI诊断原发感染,并由此提出原发感染模型的暂定工作定义:(1)小鼠腹腔注射病毒后饲养观察1个月以内;(2)血清学检测小鼠血清中HCMV特异性IgM抗体阳性,IgG-AI<50%;(3)在组织器官中检测到感染性的病毒颗粒;(4)与正常对照组相比较,HE染色显示感染的组织有明显病理学改变;(5)感染的组织器官中同时存在HCMV UL83及UL65 DNA,且基因进行相应的转录和表达。(二)通过对HCMV原发感染小鼠模型的研究以及临床标本检测结果, pp65 IgG-AI检测可用于初步诊断HCMV原发感染,pp65诊断试剂尿素变性间接ELISA法简单易行,只需在常规IgG的ELISA实验中增加了变性后洗脱的步骤,不要求特殊设备,易于各种级别医院开展,可用于临床诊断。