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昆白小鼠是我国自主繁殖的近交系小鼠,由于其遗传背景清楚、生殖周期短、环境适应能力强等优点,是国内良好的实验动物模型。本研究以昆白小鼠为研究对象,分离了子宫内膜上皮细胞,对卵母细胞的孤雌激活、孤雌胚胎的发育潜能进行了研究,探讨了影响孤雌激活和发育的几个因素,为孤雌胚胎干细胞的分离、建系提供一些基础。主要内容有以下几点:
1.37℃下2.5mg/mL胰蛋白酶+0.04%EDTA30min消化子宫内膜,结合刮取法,能获得活力高、数目多、细胞比较单一的子宫内膜上皮细胞,子宫内膜上皮细胞的活力随着细胞培养代数的增加而下降(噻唑蓝法检测)。
2.7%乙醇刺激小鼠卵母细胞,激活5~7min时其激活效果及孤雌胚发育较好,其桑囊胚发育率可达29.77%;
3.SrCl2激活小鼠卵母细胞时,6~10mmol/L为最佳处理浓度,3~6h为最佳激活时间,其桑囊胚发育率可达16.67%。
4.在复合激活中,7%乙醇激活5min在联合2mmol/L6-DMAP+5μg/mLCB激活3h效果最佳,其桑囊胚发育率高达35.77%。
5.添加15%FBS的CZB和mM16培养液均能较好地支持2-cell胚胎发育到囊胚(27.2%,26.3%)。同时,添加FBS的CZB和mM16组的囊胚发育率也均显著高于相应的添加BSA组(p<0.01)。
6.15%FBS的CZB和mM16培养液进行孤雌胚培养时,胚胎在mM16培养液中仅有7.45%突破2-cell阻滞。但在CZB培养液中有41.66%能发育通过2-cell期并有29.17%到达桑囊胚。
7.昆明小鼠MⅡ卵母细胞激活后在含15%FBS的CZB培养液中可较好地克服2-cell阻滞并形成桑囊胚。在培养48h添加1.1mg/mL葡萄糖对胚胎的继续发育有利。
8.颗粒细胞、输卵管上皮细胞和小鼠子宫内膜上皮细胞与小鼠孤雌胚胎共培养24h,共培养组胚胎与对照组大部分都能进行分裂。而从2-cell期进入4~8-cell期,CZB与颗粒细胞共培养组的胚胎发育无差异,但输卵管、子宫内膜上皮细胞共培养的胚胎要稍好一些(49.12%,48.23%)。CZB培养的桑囊胚发育率(32.99%)略低于其它三个共培养组的胚胎发育率(36.84%,38.71%,38.82%)(p<0.05)。因此,共培养细胞对孤雌胚的发育有一定的促进作用。