[目的]1、建立DTPA-生物素和hIgG的99mTc标记方法,并观察99mTc标记物在体内、外的稳定性及其在正常小鼠体内的分布。2、评价生物素化CD45单抗及99mTc标记生物素在人Raji细胞移植瘤裸鼠模型中三步法预定位放免显像价值。[材料与方法]1DTPA-生物素和hIgG的99mTc标记及其在正常小鼠体内生物分布研究1.1实验动物4-6周龄昆明种小白鼠24只(雌雄不限),质量19-21g,由南方医科大学实验动物中心提供。1.299mTc标记DTPA-生物素99mTc标记DTPA-生物素采用直接标记法,纸层析法测定其标记率,固定相为新华1号虑纸,展开剂为丙酮和生理盐水,分别在标记后Oh、1h、3h、6h、12h采用纸层析法测定放化纯度。1.399mTc标记hIgG99mTc标记hIgG采用巯基乙醇直接还原法,纸层析法测定其标记率,固定相为新华1号滤纸,展开剂为30%氨水：乙醇：水(1：2：5)和生理盐水,分别在标记后0h、1h、3h、6h、12h采用纸层析法测定标记率及放化纯度。1.499mTc-DTPA-生物素和99mTc-hIgG的体外稳定性实验分别取500μl的99mTc-DTPA-生物素和99mTc-hIgG溶液,加入1m1的生理盐水(NS)中,放置37℃温育箱中温育至12h,分别于1h、3h、6h、12h取样,用纸层析法测定放化纯度。1.599mTc-DTPA-生物素和99mTc-hIgG在正常小鼠体内的生物分布及显像取24只昆明种小白鼠,随机分为2组,每组12只小鼠,第一组为静脉注射99mTc-DTPA-生物素组,第二组为静脉注射99mTc-hIgG组。每组于尾静脉注射7.4MBq/100μl的99mTc标记物后1h、3h、6h和12h各取3只小鼠分别进行体外SPECT显像,于显像后断颈处死,取肝、脾、肾、肺、胃、肠、肌肉、骨骼及血液,称重后在放射免疫γ计数器中测量放射性计数,经放射性衰变校正后计算各脏器的每克组织百分注射剂量率(%ID/g)2CD45单抗介导的淋巴瘤荷瘤裸鼠三步法预定位放免显像研究2.1Raji细胞株Raji细胞株由南方医科大学南方医院血液科提供。用RPMI1640培养液培养,加入10%胎牛血清,在37℃和5%CO2和95%相对湿度的孵箱内孵育。2.2流式细胞仪检测Raji细胞CD45表达收集对数期生长的Raji细胞,PBS洗涤2次,计数细胞,分管,106/管,加入CD45单抗,同型IgG1作为阴性对照抗体,4℃孵育30min,PBS洗涤,用流式细胞仪分析样本中阳性细胞数,计算荧光标记阳性细胞的百分率。2.3建立淋巴瘤实验动物模型(1)4-6周龄裸鼠24只(雌雄不限),质量18-22g,由广东省实验动物中心和南方医科大学实验动物中心提供。(2)收集对数期生长的的Raji淋巴瘤细胞株并离心,生理盐水制成悬浮液(>1×108/mL),每只裸鼠双侧臀部皮下注入0.2ml,无特定病原体(SPF级)环境下饲养,待肿瘤细胞种植于裸鼠臀部皮下后,记录肿瘤成瘤时间,成瘤后每2天用游标卡尺测量肿瘤最长径a和最短径b。2.4生物素化CD45单抗的制备取2mg CD45单抗,按CD45单抗：生物素酯(摩尔比)=1：30-1：50取样,在O.1M PH8.5碳酸氢钠溶液中反应(1m1),室温下用玻璃棒轻轻搅拌1小时,将反应液注入PD-10层析柱内,放入离心器中(3000转/minx2次)离心层析。2.5采用HABA/Avidin试剂进行抗体CD45生物素化程度测定取收集的生物素化CD45单抗100μl,加入900ul的HABA/Avidin试剂中进行反应。由于游离的生物素与HABA/Avidin发生反应约1分钟后,当反应体系的颜色由橙红色转为淡黄色时,测量其500nm的OD值。抗体生物素化程度的计算(根据HABA/Avidin试剂说明书)2.699mTc标记生物素及99mTc标记CD45单抗参见标记部分。2.7淋巴瘤荷瘤裸鼠三步法预定位体内生物分布测定取人Raji细胞移植瘤裸鼠12只,每个时间点3只裸鼠,尾静脉注射生物素化CD45单抗100μg/100μL,48h后尾静脉注射亲和素(Avidin)200μg/100μL再过48h尾静脉注射99mTc-DTPA-生物素7.4MBq(20gg/100μl),注药后1h、3h、6h、12h断颈处死裸鼠后,取肝、脾、肾、肺、胃、肠、肌肉、骨骼、血液及肿瘤,称重后在γ计数仪中测量放射性计数,经放射性衰变校正后计算各脏器的%ID/g及肿瘤／非肿瘤(T/NT)比值。2.8淋巴瘤荷瘤裸鼠三步法预定位放免显像取淋巴瘤荷瘤裸鼠6只,随机分为2组,每组3只。实验组为三步法预定位放免显像组,具体给药时间及方法同上述生物分布实验；对照组为99mTc标记CD45单抗放免显像组,静脉注射99mTc-CD45单抗100μg/100μL,分别于注药后3h、6h、12h进行SPECT显像。上述两组裸鼠于12h的SPECT显像结束后,处死所有裸鼠,分离各脏器,称重并测量放射性计数,经放射性衰变校正后计算各脏器的%ID/g和T/NT比值,并进行对比。2.9统计学分析全部实验数据采用SPSS13.0统计软件进行统计分析处理,定量参数(12h的T/B、12h的T/M)用均数±标准差(X±S)表示,两样本比较采用独立样本t检验,P<0.05有显著性差异。[结果]1DTPA-生物素和hIgG的99mTc标记及其在正常小鼠体内生物分布研究1.199mTc-DTPA-生物素和99mTc-hIgG的标记率及放化纯度测定用纸层析法测定99mTc标记DTPA-生物素的标记率>80%,99mTc标记hIgG的标记率>70%,经PD-10层析柱分离纯化后99mTc-hIgG的放化纯度>90%。1.299mTc-DTPA-生物素和99mTc-hIgG的体外稳定性测定99mTc-DTPA-生物素在NS中温育12h均处于较稳定状态,放化纯度均>75%;99mTc-hIgG在NS中温育12h均处于稳定状态,放化纯度均>85%。1.399mTc-DTPA-生物素和99mTc-hIgG在小鼠体内的SPECT显像(1)99mTc-DTPA-生物素在注药后1h、3h、6h、12h小鼠SPECT显像结果显示,99mTc-DTPA-生物素在肾内摄取高,提示主要经泌尿系统排泄,血液及肌肉放射性分布较少,影像较淡。(2)99mTc-hIgG在注药后1h、3h、6h、12h小鼠SPECT显像结果显示,小鼠肝脏和脾脏内见明显放射性聚集,12h内血池见较多放射性分布,而肠道、肌肉、骨骼内放射性分布较少。2CD45单抗介导的淋巴瘤荷瘤裸鼠三步法预定位放免显像研究2.1Raji细胞CD45表达及Raji细胞移植瘤裸鼠模型构建流式细胞仪测得Raji细胞CD45表达率为78.5%。24只裸鼠有16只成瘤,移植瘤成活率为67%。2.2生物素化CD45单抗的生物素化程度测定平均每个CD45单抗结合12个生物素分子2.399mTc-CD45单抗在淋巴瘤裸鼠模型中的放射免疫显像研究静脉注射99mTc-CD45单抗后3h、6h、12h荷瘤裸鼠SPECT显像示：肝脏、脾脏及肾脏内见明显放射性聚集,12h血池内见较多放射性分布,12h肿瘤部位见有少量放射性集聚,12h肿瘤的%ID/g为0.89±0.13,肿瘤/血液比值为1.6,肿瘤/肌肉比值达到2.5。2.4淋巴瘤荷瘤裸鼠三步法预定位放免显像及生物分布研究三步法给药后1h、3h、6h、12h荷瘤裸鼠SPECT显像示：整个显像期间血池内放射性均较低,肝脏和脾脏内见较多放射性浓聚；注射标记物1h后,移植肿瘤隐约显影,随着时间的延长,肿瘤内放射性浓聚逐渐增多,3-6h肿瘤显影清晰,并持续到12h。注药后3h、6h和12h肿瘤的%ID/g分别为1.73±0.22、1.24±0.03和0.94±0.07；肿瘤/血液比值分别为3.5、4.9和7.8；肿瘤/肌肉比值分别为到8.2、8.9和10.4。[结论]199mTc标记DTPA-生物素和IhIgG的标记率分别>80%和>70%,99mTC标记标记hIgG的放化纯度>90%,具有良好的体外稳定性,小鼠体内的生物分布实验表明,99mTc-生物素和99mTc-hIgG在体内的血清除速率及生物学分布明显不同,为进一步的预定位放免显像研究中亲和素-生物素系统的不同组分的选择提供实验数据。2与99mTc直接标记CD45单抗相比较,99mTc-DTPA-生物素三步法预定位技术在CD45单抗淋巴瘤裸鼠模型放射免疫显像中的应用,显著改善肿瘤的T/NT比值,标记物注射后1h肿瘤即可见显影,3h肿瘤显影清晰,从而达到肿瘤早期显像的目的。上述研究成果为下一步开展CD45单抗三步法预定位放免治疗裸鼠淋巴瘤移植瘤的研究提供实验依据。