研究背景神经元是一种高度极化的细胞。它发育出一条较长的轴突及多条高度分支的树突,对于神经网络的正确构建十分关键。在这两个发育事件中,轴突的生长对于神经系统的发育及损伤后修复具有至关重要的作用。虽然轴突的发育调节作为一个热点的研究领域已经很多年,但是,目前在哺乳动物的大脑中轴突生长的信号调节机制仍不十分清楚。JNK相互作用蛋白(JIPs)家族包含一系列在JNK信号通路中发挥支架作用的蛋白。JIP3作为JIPs家族的成员之一,已经被证实可以通过与JNK信号通路的多种蛋白相结合,调节该通路的活性。而JNK信号通路对于轴突的形成与生长,突触的可塑性及树突的发育,都发挥着非常重要的作用。目前已经证实,JIP3在线虫中的同源异构体UNC-16及在果蝇中的同源异构体Sunday Driver,在kinesin介导的货物的轴突转运中,都发挥着多种货物的支架蛋白的作用。而且该分子还刚刚被我们证实,在大鼠的海马神经元中可以介导TrkB的顺轴突转运。所以,不论在非哺乳动物还是哺乳动物中,JIP3对于一些分子在轴突内的运输都发挥着重要的作用。有意思的是,JIP3还选择性地在胚胎期及成年期老鼠的大脑神经元的胞体及轴突的末端表达。综上所述,这些研究提示JIP3对于轴突的发育有着潜在的调节作用。最近的一项研究发现,JIP3可以通过GSK3β/DCX信号通路抑制轴突的分支。但是,JIP3是否在轴突发育的其他方面(如轴突的特化及生长)发挥作用,目前还不清楚。另外,同样作为JIPs家族成员的JIP1最早也被发现可以通过与JNK信号通路的多种成分相结合,进而促进JNK的激活。后来又有研究发现,在神经系统中,JIP1还可以作为支架蛋白,介导多种货物的运输。TrkB为脑源性神经营养因子(BDNF)的高亲和性受体。神经元内TrkB分子正确的由胞体转运至轴突末端,对于BDNF信号的实现十分重要。另有文献证实,TrkB可以在Slpl/Rab27B/CRMP-2三分子复合物或JIP3的介导下,通过两条完全不同的途径进行顺轴突的转运。但是,在顺轴突转运中TrkB的转运是如何被精确调节的,以及JIP3的同家族成员JIP1是否也参与了这一转运过程,目前还不清楚。研究目的1、探讨JIP3对于神经元轴突的发育是否具有调节作用。2、进一步研究JIP3影响轴突发育的具体的分子机制。3、研究JIP1对于神经元轴突内TrkB的顺轴突转运具有调节作用。研究方法1、大鼠海马神经元的培养与转染断椎法处死怀孕18天的Sprague-Dawley大鼠,于超净工作台中取出胚胎,然后在解剖显微镜下取出胎鼠大脑的海马组织。将所有海马组织用镊子撕成小块后,置于己预热的0.05%胰酶/EDTA溶液中37℃消化10min,然后用抛光的巴斯德管将组织轻轻吹打分散为单细胞。经血细胞计数板计数后,将神经元按照需要的密度接种于已经经过0.1mg/mL多聚赖氨酸包被的培养皿或培养板中,在饱和湿度,5%CO2及37℃恒温的条件下进行培养。神经元培养液成分为：Neurob asal+2%B27+0.5mM谷氨酰胺。对于准备接种用于免疫细胞化学染色的神经元的六孔培养板,需在接种细胞前在培养板的孔内先加入一片灭菌的盖玻片,然后再进行0.1mg/mL多聚赖氨酸的包被。神经元转染则是利用Amaxa Biosystems公司的细胞电转染仪Nucleofector进行,具体方法见该产品的使用说明书。2、免疫细胞化学染色体外培养的海马神经元在培养到第5天时,用4%多聚甲醛固定10min；然后用PBS洗3次,每次5min；接下来0.4%Triton X-100打孔10min;在用PBS洗涤后,用含10%的正常山羊血清或驴血清的封闭液室温封闭1h；PBS配制的一抗40C孵育过夜后,继续用PBS洗涤3次；然后二抗室温孵育1h,PBS洗涤后,即可封片观察。3、胚胎宫内电转孕15.5天的C57BL/6小鼠,经腹腔注射水合氯醛麻醉。暴露胚胎后,通过显微注射将混有Fast Green的质粒溶液注射到胚胎脑的侧脑室中。然后用连接有电转仪(CUY21SC, NEPA Gene)的一对电极(CUY650-P7)夹持胚胎脑部,隔着子宫壁进行方波电击(共电击5次,每次电压30V,持续时间为50ms,每次之间间隔为950ms)。电转完成后将胚胎放回母鼠腹中,行外科缝合。待母鼠苏醒后,即可放回饲养笼中继续饲养。4、Microfluidic Chamber中神经元的培养Microfluidic Chamber由多聚二甲基硅氧烷(PDMS)制成。这些Chamber有两个平行的小室(2mm宽,100μm高),这两个小室由400个小的孔道(450μm长,10pm宽,3um高)连接,这些孔道可以使轴突特异性地通过并到达对侧小室,而树突则不能通过。在接种神经元前,首先应将干净灭菌的Microfluidic Chamber扣到多聚赖氨酸包被过的60m培养皿中,然后再将神经元接种到胞体端的小室中,10-15min后,神经元即可贴壁。培养4天后,轴突可通过孔道到达突起端的小室。结果1、JIP3通过依赖于kinesin-1及JNK信号通路的方式调节神经元轴突生长的研究1.1JIP3在体外培养的海马神经元发育的过程中表达量显著提高利用Western blot,我们发现JIP3在体外培养的海马神经元中表达量逐渐增大,尤其是在轴突生长的关键阶段,也就是在培养的第2-4天,其表达量有显著的提高。另外,我们又通过免疫细胞化学的方法发现,JIP3在处于Stage2和Stage3的神经元中均有表达。但有意思的是,在神经元从Stage2(有几条相同长度的突起,尚不能区分轴突与树突)发育到Stage3(有一条突起迅速生长,进而发育为轴突)时,JIP3的分布由所有突起都有分布,逐渐演变为集中分布于轴突的末端。上述结果提示JIP3在海马神经元轴突发育的过程中,可能有着重要的作用。1.2JIP3在体外促进海马神经元轴突的生长我们首先利用分子克隆的手段,制作了JIP3的过表达质粒以及干扰质粒,在证实了这些质粒表达正常后,我们再结合免疫细胞化学的手段,证实了JIP3对海马神经元轴突的生长具有促进作用,但是对于海马神经元轴突的特化及树突的生长没有影响。1.3JIP3在体内促进皮层神经元轴突的生长为了进一步了解在动物体内JIP3是否亦对神经元的生长具有促进作用,我们选用了胚胎电转的技术进行进一步的研究。实验结果证实JIP3表达的下调并不影响多级神经元与双极/单级神经元的比例,提示在体内JIP3并不影响皮层神经元轴突的特化。进一步,在JIP3表达下调的情况下,皮层神经元的轴突沿着肼胝体向大脑对侧的投射长度明显小于对照组,这就说明,JIP3在体内对于神经元轴突的生长亦具有明显的促进作用。1.4筛选JIP3分子中对促进神经元轴突生长具有关键作用的结构域我们根据文献中报道的JIP3中存在的一些功能区域,利用分子克隆技术,制作了一系列的JIP3的结构缺失突变体,然后利用这些突变体及免疫细胞化学的手段,确定了JIP3△KBD△LZ(JIP3△△)及JIP3△JBD两个突变体丧失了促进海马神经元轴突生长的作用,说明JIP3的这些结构域对于其促进海马神经元轴突的生长具有关键的作用。1.5JIP3需首先成功被转运到轴突末端,才能实现其对海马神经元轴突生长的促进作用根据文献报道,JIP3△△突变体不能被正常转运到轴突的末端,故我们猜测JIP3成功转运至轴突末端对其发挥促进轴突生长的功能具有关键的作用,所以我们采用了干扰RNA技术,制作了负责运输JIP3到轴突末端的马达蛋白Kif5的小片段siRNA,并证实在Kif5表达被下调的情况下,JIP3转运到轴突末端的量显著降低。在此基础上,我们又利用免疫细胞化学的技术证实JIP3在Kif5表达受抑制的情况下,亦丧失了促进轴突生长的作用,证实JIP3成功转运至轴突末端对其促进海马神经元轴突生长发挥关键作用。1.6JIP3通过特异性激活轴突末端的JNK分子来促进轴突的生长以往文献通过体外实验证实JIP3可以促进JNK的激活,而该功能是依靠其JBD结构域实现的,但是该功能在神经元内是如何实现的,目前还不清楚。利用Western blot的方法,我们发现在处于发育阶段的海马神经元中,JIP3并不影响细胞整体上JNK的活性。但是免疫细胞化学的结果又告诉我们,JIP3可以显著提高轴突末端JNK的活性,JIP3ΔJBD则恰恰可以抑制轴突末端JNK的活性,这些结果证实了在发育的神经元中,JIP3可以特异性地促进轴突末端,JNK的激活。那么JIP3对轴突生长的促进作用与其对轴突末端JNK的激活作用是否有必然的联系呢?我们采用了microfluidic chamber来研究神经元轴突及胞体部分的JNK活性在被分别抑制的情况下,JIP3是否还能促进轴突的生长。首先,我们利用microfluidic chamber证实,在胞体端JNK活性被特异性抑制的前提下,轴突端的JNK活性没有受到影响；同样的,如果轴突端的JNK受到抑制,胞体端的JNK活性亦不受影响。然后,我们便进一步统计不同组轴突的长度,证实在胞体端JNK被抑制时,JIP3依然可以促进轴突的生长,这也证实了我们统计方法的准确性；而在轴突端JNK被抑制的情况下,JIP3丧失了促进轴突生长的作用,这证实了JIP3对轴突生长的促进作用恰恰是通过促进轴突末端JNK的激活来实现的。1.7JIP3通过JNK-cofilin通路来调节轴突末端的F-actin dynamics,并进而促进轴突生长JIP3是如何通过激活JNK来促进轴突生长的呢?我们的研究发现JIP3可以促进轴突末端filopodia的数目以及长度的增加,这提示JIP3可能通过影响F-actin dynamics来促进轴突的生长。有文献报道,JNK可以促进cofilin的激活,而cofilin则可以增强F-actin dynamics,所以我们通过免疫细胞化学的手段,证实了JIP3可以促进轴突末端cofilin的激活以及F-actin的形成,而JIP3ΔJBD则无该功能。更有意思的是,当我们过表达cofilin的持续失活突变体cofilin S3E时,JIP3也失去了促进轴突生长的能力。以上结果证实了JIP3是通过激活轴突末端的JNK,然后再激活cofilin,并进一步促进F-actin的形成,最终促进轴突生长的。2、JIP1介导海马神经元中TrkB顺轴突转运的研究2.1JIPl和TrkB在体内外均存在相互作用通过外源性过表达及内源性的免疫共沉淀实验,我们证实在两种情况下JIP1与TrkB分子均能被彼此共沉淀下来,这说明JIP1与TrkB分子在体内外均能形成复合物。另外,我们还发现kinesin-1的轻链(KLCl)在进行免疫沉淀实验后,JIP1分子及TrkB分子均能被共沉淀下来,这提示了JIP1可能对于TrkB分子的顺轴突转运具有调节作用。2.2JIP1在体外培养的海马神经元中可以影响TrkB在轴突末端的分布我们在体外培养的海马神经元内分别过表达了JIP1-HA分子或者敲除了内源性的JIP1分子,然后我们通过免疫细胞化学的方法检测了TrkB分子在神经元轴突及树突末端的分布情况。实验结果表明,在体外培养的海马神经元中,JIP1对轴突末端TrkB的分布有影响,而对于TrkB在树突末端的分布并没有显著的影响。2.3JIP1与JIP3通过同一路径介导神经元内TrkB的顺轴突转运我们依然采用了与2.2中相同的方法,结果发现,不论是JIP1或JIP3分子被单独敲除,还是在两个分子同时被敲除,TrkB分子在轴突末端分布的降低程度都是没有区别的,这一结果证实JIP1分子与JIP3分子一样,是通过同一条路径对神经元内TrkB分子的顺轴突转运起到的调节作用。结论1、JIP3可以促进神经元轴突的生长,但对于轴突的特化与树突的生长没有影响。2、JIP3在轴突的末端可以特异性的促进JNK的激活,而对于胞体部位JNK的激活没有作用。3、JIP3在轴突末端,是通过影响JNK-cofilin信号通路来调节F-actin dynamics,并最终影响轴突的生长的。4、JIP1可以通过与JIP3相同的路径介导神经元内TrkB的顺轴突转运。