钛种植体在近年来迅速发展,广泛应用于牙齿缺失患者的临床治疗。但现有钛种植体仍存在愈合时间长,在疾病条件下骨结合形成差等问题。通过种植体表面改性,促进早期、良好的骨结合,成为种植体相关研究的主要方向。小干扰RNA分子(siRNA)的加载能够实现种植体表面功能化,其通过特异性地靶向并沉默目标基因的表达,提高种植体成骨活性,是改善种植体骨结合的新策略。基因载体系统是影响siRNA生物学功能的关键因素,siRNA功能化种植体成骨活性的发挥,依赖于安全性高、转染活性强的载体系统对siRNA的高效加载、保护和递送。氧化石墨烯(GO)是一种新型的纳米基因载体,功能化修饰的GO具备独特的理化和生物特性,在siRNA分子递送方面显示出巨大的应用潜力。本研究创新性地将聚乙二醇(PEG)和聚乙烯亚胺(PEI)双功能化氧化石墨烯(nGO-PEG-PEI)作为载体,实现种植体表面siRNA功能化修饰。该载体在种植体表面发挥对siRNA分子安全、高效的转运,从而达到提高种植体骨结合的目的。我们首先制备了纳米尺寸的nGO-PEG-PEI载体,通过优化配比参数,得到nGO-PEG-PEI/siRNA转染复合物。随后,通过阴极电沉积法,将该转染复合物加载在二氧化钛纳米管(NT)表面,成功制备siRNA功能化种植体NT-GPP/siRNA。在对该种植体的生物相容性及siRNA转染效率进行评价后,引入具有骨形成促进作用的Ckip-1 siRNA,通过一系列体外和体内实验评估NT-GPP/siCkip-1的成骨能力。通过该研究,为种植体表面siRNA功能化修饰提供依据,为功能化种植体的表面设计提供指导。第一部分双功能化氧化石墨烯的制备与表征【目的】制备PEG、PEI双功能化氧化石墨烯nGO-PEG-PEI,作为后续研究siRNA的载体。【方法】1.通过改良的Hummers方法,以石墨粉为原料,制备氧化石墨烯(GO);2.GO碱化后,亲水性聚合物PEG和带正电荷的聚合物PEI通过酰胺键以GO/PEG/PEI=1:1:5的重量比共价修饰,得到nGO-PEG-PEI;3.nGO-PEG-PEI的表征:透射电镜和原子力显微镜观察GO、nGO-PEG、nGO-PEG-PEI的结构;马尔文激光粒度分析仪测定GO、nGO-PEG和nGO-PEG-PEI的水合粒径和表面zeta电位;通过红外光谱观察三组材料官能团的变化;元素分析及热重分析计算nGO-PEG-PEI中PEG和PEI的加载量;考察GO、nGO-PEG和nGO-PEG-PEI在水、PBS(磷酸盐缓冲液)、α-MEM(10%FBS)(含10%胎牛血清的基础培养基)中的溶解性。【结果】1.通过改良Hummers方法,制备得到了氧化石墨烯。其粒径约为560 nm,厚度约3 nm,呈负电性,在生理溶液中溶解度较差,易形成沉淀;2.红外光谱、元素分析、热重分析等结果的变化表明,PEG及PEI能够加载在GO表面,得到nGO-PEG-PEI。nGO-PEG-PEI中N元素含量约为12.84%,PEG及PEI的加载量分别为15.7%和36.9%;3.nGO-PEG-PEI具有独特的理化特性:其具有纳米结构,粒径约53.9 nm;表面带正电,zeta电位约为30.5 m V;nGO-PEG-PEI表现出良好的溶解性,在水、PBS、α-MEM(10%FBS)中均匀分散。【结论】通过改良的Hummers法制备得到GO。将PEG、PEI加载于GO表面,成功制备出nGO-PEG-PEI,其具有独特的理化特性如纳米粒径、正电性及在生理条件下良好的稳定性。通过该部分研究,为后续siRNA加载在种植体表面提供了载体。第二部分nGO-PEG-PEI/siRNA功能化种植体的制备与表征【目的】筛选适宜的载体基因配比(N/P比),形成nGO-PEG-PEI/siRNA转染复合物,并将其加载于种植体表面,制备siRNA功能化种植体。【方法】1.以不同的N/P比(5、10、20、40和80),形成nGO-PEG-PEI/siRNA转染复合物。通过琼脂糖凝胶电泳评估不同N/P比时nGO-PEG-PEI结合siRNA的能力;2.使用CCK-8法评价nGO-PEG-PEI/siRNA复合物在不同N/P比时的细胞活性,筛选用于细胞转染的N/P配比;nGO-PEG-PEI/siRNA(FAM)细胞转染后,激光共聚焦及流式细胞仪检测荧光表达,评价转染效率。PCR进一步分析各组siRNA细胞转染后的基因沉默效应,确定最终N/P比例;3.应用阳极氧化法,在钛表面制备仿生二氧化钛纳米管结构。通过阴极电沉积法,将nGO-PEG-PEI/siRNA转染复合物加载在钛纳米管表面,得到siRNA功能化修饰的种植体NT-GPP/siRNA;4.检测不同电压下siRNA的表面沉积效率,筛选出合适的阴极电沉积电压;检测该电压下制备的NT-GPP/siRNA植体的siRNA体外释放特性,绘制释放曲线;通过原子力显微镜、扫描电镜观察、亲水性测量等方法对NT-GPP/siRNA进行表征。【结果】1.琼脂糖凝胶电泳结果显示,nGO-PEG-PEI可以在N/P比≥20时通过静电相互作用完全结合siRNA。制备的转染复合物nGO-PEG-PEI/siRNA在N/P 20-40的比例范围内时表现出良好的生物相容性;2.综合荧光显微镜、流式细胞仪及PCR检测结果,在N/P 20-40范围时,siRNA的细胞摄取及基因沉默能力与N/P比例呈正相关。N/P 40组基因转染及基因沉默的效率最高,靶基因m RNA沉默达70%;3.通过阳极氧化法,在钛表面成功构建仿生二氧化钛纳米管结构。应用阴极电沉积法,将nGO-PEG-PEI/siRNA(N/P 40)加载在该纳米管结构表面,制备出NT-GPP/siRNA功能化种植体,且10 V电压时加载效率最高;4.应用10 V电压制备NT-GPP/siRNA,并对其进行表征,siRNA能够从该材料表面持续释放,维持约16天。同时,加载nGO-PEG-PEI/siRNA后,材料表面形貌发生明显变化,粗糙度、亲水性等显著提高。【结论】1.筛选出具有高siRNA结合能力、良好生物相容性及高效基因转染能力的N/P比,制备nGO-PEG-PEI/siRNA转染复合物;2.应用阴极电沉积法,将nGO-PEG-PEI/siRNA转染复合物加载到钛纳米管表面,成功制备siRNA功能化种植体NT-GPP/siRNA。3.优化nGO-PEG-PEI/siRNA转染复合物加载电压,该电压制备的NT-GPP/siRNA能够实现siRNA稳定、持续的释放。同时,材料表面形貌及理化特性发生显著变化。第三部分NT-GPP/siRNA的体外转染研究【目的】评价NT-GPP/siRNA的生物相容性,检测该种植体表面的siRNA转染和基因沉默效率,为后续体内外应用奠定基础。【方法】1.NT-GPP/siRNA生物相容性研究:BCA蛋白定量检测NT-GPP/siRNA表面蛋白吸附;激光共聚焦显微镜(CLSM)和扫描电镜(SEM)观察材料表面黏附细胞的形态及F-actin细胞骨架分布;CCK-8法检测细胞增殖活力;2.NT-GPP/siRNA表面siRNA转染研究:选择FAM-siRNA,激光共聚焦观察siRNA入胞效率及入胞后定位;GFP+MC3T3-E1在NT-GPP/si GFP试样表面接种后,观察GFP荧光表达的变化;引入Ckip-1 siRNA制备siRNA功能化种植体NT-GPP/siCkip-1,PCR检测NT-GPP/siCkip-1细胞转染3天及7天后的siRNA沉默效率。【结果】1.NT-GPP/siRNA表面蛋白吸附能力显著上升,约为PT组的2倍,NT组的1.3倍;2.在NT-GPP/siRNA表面,细胞伸展良好,面积增大,细胞间丝状伪足连接增多;胞浆内细胞肌动蛋白丝F-actin表达增多,排列规则有序;在接种后的1、3、7天,NT-GPP/siRNA组均可以促进细胞增殖,未见明显细胞毒性;3.NT-GPP/siRNA表面siRNA转染入胞后,siRNA绿色荧光在胞质中大量表达,围绕细胞核排列;NT-GPP/si GFP表面接种GFP+MC3T3-E1后,细胞内绿色荧光蛋白表达显著降低;NT-GPP/siRNA发挥基因沉默作用,使靶基因Ckip-1的表达在转染后3天及7天均下调约70%。【结论】1.NT-GPP/siRNA表现出良好的生物相容性,促进了表面蛋白吸附、细胞早期黏附及细胞骨架的分布,且未见明显细胞毒性。2.NT-GPP/siRNA能够实现siRNA的高效转染。siRNA入胞后,到达细胞内特定的位置,发挥基因沉默作用,显著下调靶基因的表达。第四部分NT-GPP/siCkip-1的体内外成骨活性研究【目的】评价NT-GPP/siRNA种植体的体外细胞成骨分化及体内骨结合。【方法】1.体外成骨分化的评价:NT-GPP/siCkip-1表面接种细胞后,在特定时间点,进行成骨碱性磷酸酶(ALP)、胶原分泌、细胞外基质(ECM)矿化染色及半定量分析,并检测成骨相关基因ALP、COL-1、BMP2和Runx2的表达;2.体内骨结合的检测:将NT-GPP/siCkip-1种植体植入C57BL/6J小鼠股骨内,1月后,应用Micro-CT重建分析、组织学VG染色、SEM观察、EDX线扫描等评价体内骨结合。【结果】1.NT-GPP/siCkip-1种植体表面ALP表达、胶原分泌、ECM矿化染色及半定量分析的结果均表现为NT-GPP/siCkip-1>NT-GPP/si NC≈NT-GPP>NT>PT组。PCR结果显示,NT-GPP/siCkip-1组ALP、COL-1、Runx2和BMP2成骨相关基因的表达均显著提高。2.Micro-CT重建分析,NT-GPP/siCkip-1试样周围新骨形成量明显增高,致密的新骨几乎完全覆盖并包绕在在整个种植体周围;组织学VG染色可见,NT-GPP/siCkip-1组在植体表面形成的新骨形成量最多,且显示出最好的骨连续性,骨接触率也最高;对骨种植体界面进行SEM观察及EDX线扫描,材料表面富含Ca、P元素的新骨与NT-GPP/siCkip-1种植体之间表现出直接且紧密的结合,未出现纤维组织等结构。【结论】1.NT-GPP/siCkip-1种植体能够显著提高ALP合成、胶原分泌、ECM矿化能力及成骨相关基因表达,促进体外成骨分化。2.NT-GPP/siCkip-1种植体体内应用时,新生骨组织量最多,且骨组织致密、连续,与种植体紧密结合,形成良好的骨结合。